Generierung, Charakterisierung und Funktionalisierung rekombinanter Antikörperfragmente gegen leukämische und dendritische Zellen : Entwicklung diagnostischer und immuntherapeutischer Werkzeuge mit Hilfe der „Phage Display“-Technologie

Fitting, Jenny; Barth, Stefan

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-43079

Generierung, Charakterisierung und Funktionalisierung rekombinanter Antikörperfragmente gegen leukämische und dendritische Zellen : Entwicklung diagnostischer und immuntherapeutischer Werkzeuge mit Hilfe der „Phage Display“-Technologie = Generation, characterization and functionalization of recombinant antibody fragment against leukemic and dendritic cells : development of diagnostic and immunotherapeutic tool using phage display technology

Fitting, Jenny

2012 & 2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jenny Fitting

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

UmfangIV, 296, X Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012

Zsfassung in dt. und engl. Sprache. - Prüfungsjahr: 2012. - Publikationsjahr: 2013

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Barth, Stefan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-09-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-43079
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/228919/files/4307.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Phagen-Display-Bibliothek (Genormte SW) ; Akute myeloische Leukämie (Genormte SW) ; Dendritische Zelle (Genormte SW) ; Immuntherapie (Genormte SW) ; Naturwissenschaften (frei) ; Internalisierung (frei) ; single-chain variable fragment (frei) ; acute myeloid leukemia (frei) ; dendritic cell (frei) ; immunotherapy (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 500

Kurzfassung
In den letzten Jahren hat die onkologische Immuntherapie als adjuvante Strategie und sogar in der Erstlinientherapie zur Behandlung maligner Erkrankungen zunehmend an Bedeutung gewonnen. Den größten Bestandteil bilden dabei monoklonale Antikörper, deren Fragmente und Konjugate. Sie sind mittlerweile fester Bestandteil einiger Behandlungskonzepte in der Krebstherapie. Ihr Vorteil liegt in der Differenzierung zwischen gesunder und erkrankter Zelle durch die spezifische Identifizierung des Zielantigens. Maligne hämatologische Erkrankungen, wie die akute myeloische Leukämie (AML), eignen sich besonders gut für eine immuntherapeutische Behandlung, da sich die Zielzellen in der Blutbahn befinden und somit direkt zugänglich für intravasal applizierte, antikörperbasierte Immuntherapeutika sind. Obwohl das zytostatische Therapiekonzept bedeutende Fortschritte gemacht hat, ist die 5 Jahres-Überlebensrate nach AML Diagnose in den letzten Dekaden nicht über 24% gestiegen. Gründe dafür liegen in der multiplen Chemotherapieresistenz sowie in einer sich der Chemotherapie entziehenden minimalen Resterkrankung, die mit einer erhöhten Rezidivrate und einer ungünstigen Prognose einhergehen. Die Entwicklung neuartiger Immuntherapeutika könnte eine positive Auswirkung auf die Lebensqualität und sogar eine verbesserte Überlebensrate von Krebspatienten bringen. Die erste Zielsetzung dieser Arbeit beinhaltete die Generierung AML-spezifischer Antikörperfragmente (scFv) mit Hilfe der „Phage Display“ Technologie. Dabei gelang es, eine Selektionsmethode auf einer AML-abgeleiteten Zelllinie in Suspension zu etablieren, bei der der Fokus auf internalisierenden scFv-Antikörpern lag. Es wurden neun zelloberflächenbindende scFv-Antikörper isoliert, deren funktionale Bindeaffinität als SNAP tag Fusionsprotein im nanomolaren Bereich lag. Vier davon zeigten eine positive Färbung von Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten (FFPE) Beckenkammbiopsien AML-diagnostizierter Patienten in der Immunhistochemie. Diese vielversprechenden Ergebnisse lassen auf deren möglichen Einsatz in der Differentialdiagnostik der AML hoffen. Des Weiteren zeigten vier der selektionierten scFv-Antikörper in der Konfokalmikroskopie und Durchflusszytometrie Internalisierungsverhalten und wurden daher durch Fusion an die zelltoxische Domäne ETA zu Immuntoxinen funktionalisiert. Das Immuntoxin C3(scFv) ETA zeigte dabei eine proliferationshemmende und apoptoseinduzierende Aktivität auf den AML Zellen in vitro. Die gemessene Zytotoxizität mit einer IC50 von 265 nM soll in zukünftigen Arbeiten durch verschieden Strategien, wie beispielsweise die Koadministration von Adjuvanzien oder die Erhöhung der Antigenexpression, noch gesteigert werden. Es besteht daher auch weiterhin Hoffnung auf eine mögliche therapeutische Anwendung dieses Immuntoxins zur effizienten, selektiven Schädigung und Vernichtung von AML Zellen. Neben dieser passiven Immuntherapie besteht die Entwicklung aktiver Immuntherapien, die eine patienteneigene Immunantwort gegen die malignen Zellen provozieren. Dabei steht die Vakzinierung mit dendritischen Zellen auf Grund ihres effektiven immunstimulatorischen Potenzials im Vordergrund klinischer und präklinischer Forschungsarbeiten. Der Erfolg dieser Strategie ist stark abhängig von der Migration der injizierten DZ in die drainierenden peripheren Lymphorgane. Zur Verbesserung dieser onkologischen Vakzinierungsstrategie bedarf es daher einer zuverlässigen Aufklärung ihres Migrationsverhaltens nach ihrer Administration. In der zweiten Zielsetzung dieser Arbeit sollten spezifische scFv-Antikörper gegen canine dendritische Zellen (cDZ) unter Anwendung der „Phage Display“ Methodik generiert werden. Die Selektion wurde gegen ein unbekanntes Antigen auf biologisch aktiven Membranfragmenten der generierten cDZ Zellpopulation (Prof. Junghanß, Universität Rostock) durchgeführt. Es konnten acht cDZ-spezifische scFv-Fragmente im monoklonalen Phagen-ELISA identifiziert werden. Eine reproduzierbare Bindung wurde jedoch nur für die scFv-Antikörper C2 und C3 im scFv ELISA bestätigt. Der Erfolg dieser scFv-Isolation war zu Beginn dieser Arbeit ungewiss, weil die Selektion auf dem Zellmaterial eines einzelnen Hundes durchgeführt wurde. Da die scFv-Fragmente in ihrer späteren Anwendung auch Zellen anderer Hunde der gleichen Rasse spezifisch erkennen sollten, war die gewünschte Kreuzreaktivität eine zentrale Fragestellung in der Charakterisierung ihrer Bindeeigenschaften. In über 70% der getesteten Zellchargen konnten wir eine positive Bindung der beiden scFv-SNAP Fusionsproteine dokumentieren. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten haben wir das Internalisierungsverhalten der scFv untersucht und die zelluläre Aufnahme des C2(scFv) SNAP Fusionsproteins beobachtet. Zukünftige Forschungsarbeiten könnten die Untersuchung einer in vivo Vakzinierungstrategie durch das selektive Herantragen tumorspezifischer Antigene mit Hilfe eines C2(scFv)–Antigen Fusionsproteins beinhalten.

Over the last years, cancer immunotherapy has gained great significance in adjuvant settings and first-line treatment of oncologic malignancies. Therein, monoclonal antibodies, their fragments and conjugates play a crucial part in specific immunotherapy and have now become a part of standard cancer treatment. Due to their ability to specifically identify their target antigen, they reliably differentiate between benign and malignant cells. Hematologic malignancies as the acute myeloid leukemia (AML) for example, are ideal for a treatment with antibody-based drugs. The reason is that malignant cells are often intravascular and therefore accessible to intravenously administered immunotherapeutic agents. Although the cancer treatment regime has been improved significantly over the last decades, the 5-year survival rate is still only 24%. The high mortality correlates with a high relapse rate after complete remission leading to a bad prognosis. The major cause for relapse is the minimal residual disease, a small number of leukemic cells that remain after remission. The development of novel AML-specific immunotherapeutic agents would have benefits for the patient´s quality of life and may prolong the relapse-free survival. Therefore, we aimed to generate specific scFv-antibody fragments using the Phage Display Technology. Using a whole cell panning strategy on an AML-derived cell line, we set the selection pressure on internalizing scFv-fragments. Nine sequence unique scFv-antibodies binding to the cell surface were identified, revealing a nanomolar binding affinity as scFv SNAP-tag fusion proteins. Four of them showed a positive staining on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) bone marrow tissue of AML diagnosed patients in immunohistochemistry. These observations are the first promising results for the development of a novel diagnostic tool in AML. However, the identity of the bound antigen remains unknown and has to be elucidated to assess the relevance of scFv for diagnostic purposes. Moreover, four scFv-antibodies proofed to internalize into the cell cytosol by confocal microscopy and flow cytometry. Consequently, they were fused to a truncated version of Pseudomonas Exotoxin A (ETA) for recombinant immunotoxin construction. The immunotoxin C3(scFv)-ETA was shown to inhibit cell proliferation and to induce apoptosis in AML-derived cells with an IC50 of 265 nM in vitro. Subsequent studies aim to increase the cytotoxic potential of this molecule via either the addition of adjuvant reagents or the upregulation of surface antigen expression. The data obtained in this thesis demonstrate a putative novel immunotherapeutic approach for effective and selective targeting of leukemic cells in AML therapy. In contrast to this passive approach, active cancer immunotherapy induces a patient’s tumor specific immune response. Most clinical and preclinical studies focus on cancer vaccination with systemically administrated dendritic cells (DC), due to their high immunostimulating potential. A major prerequisite for a successful tumor vaccination is an efficient DC migration to the peripheral lymphoid organs. Monitoring the DC migration behavior after their reinjection would give precious insights which might help to improve the vaccination strategy. Therefore, we aimed to select specific scFv-antibodies against canine dendritic cells (cDC) using the Phage Display Technology. After the biopanning on functional membrane fragments of freshly generated cDC (Prof. Junghanß, University of Rostock), we identified eight unique cDC-specific scFv-antibodies in monoclonal phage-ELISA. Two binders designated C2 and C3 confirmed reproducible binding activity in scFv-ELISA when expressed as soluble proteins. The selection was carried out on cDC membrane fragments of only one dog, but future applications will require the cross-reactive binding of several cDC of the same breed. Therefore, we checked for cross-reactivity to allogeneic cell membranes. At least 70% of the tested membranes were specifically bound by the fusion proteins C2(scFv)-SNAP and C3(scFv)-SNAP, thereby demonstrating a positive cross reactivity. Additionally, we checked for internalization behavior in confocal microscopy and observed cellular uptake of C2(scFv)-SNAP when incubated with viable cDC under physiologic conditions. These characteristics would allow a targeted delivery and processing of tumor specific antigen by the DC when fused to the selected C2(scFv). Further studies could evaluate the use of such a recombinant fusion protein for the development of a putative in vivo vaccination strategy.

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