Engineering the multigene pathways for CO 2 concentration mechanism and bypassing the photorespiration in C 3 plants

Kamble, Pratibha; Kreuzaler, Fritz

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-49824

Engineering the multigene pathways for CO 2 concentration mechanism and bypassing the photorespiration in C 3 plants = Konstruktion multigener Stoffwechselwege zur CO2-Anreicherung, durch modifizierung der Photorespiration in C3-Pflanzen

Kamble, Pratibha

2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Pratibha Kamble

ImpressumAachen 2014

Umfang185 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Kreuzaler, Fritz (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-01-17

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-49824
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/229445/files/4982.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Stoffwechselweg (Genormte SW) ; Lichtatmung (Genormte SW) ; C3-Pflanzen (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; CO2-Anreicherung (frei) ; photorespiration (frei) ; multigene pathway (frei) ; C3 plants (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Der Enzymkomplex Ribulose 1,5-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco) ist von überragender Bedeutung für das Leben und für die Umwandlung von Lichtenergie in Bioprodukte wie Kohlenhydrate, Lipide, Proteine, Nukleinsäuren, usw. Leider hat dieser wichtige Enzymkomplex einen großen Nachteil, der sich besonders negativ in der Landwirtschaft bemerkbar macht. Neben der Carboxylierungs-Reaktion katalysiert die Rubisco auch die Oxygenierungs-Reaktion. Letztere führt zu einer Verminderung der maximal möglichen Biomasseproduktion, allerdings nur bei C3-Pflanzen wegen der Photorespiration. Zu diesem CO2-Fixierungstyp gehören allerdings die wichtigsten Kulturpflanzen wie Weizen, Reis, Kartoffel und die Zuckerübe. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zwei Möglichkeiten zu untersuchen, die Oxygenase-Reaktion der Rubisco zu inhibieren. Die Grundstrategie zur Inhibition der Oxygenase und damit zu Erhöhung der Carboxylase-Reaktion besteht darin, die CO2 Konzentration in den Chloroplasten, also in der unmittelbaren Nähe der Rubisco zu erhöhen. Die erste potentielle Möglichkeit zur Erreichung des Zieles besteht darin, einen Biosyntheseweg in C3-Kulturpflanzen (N. tabacum) einzubauen, wie er bei der submers lebenden Pflanze Hydrilla verticillata vorgefunden wird. Diese Pflanze kann bei niedrigen CO2-Konzentrationen in Wasser einen CO2-fixierungs Mechanismus induzieren, der aber in Gegensatz zu normalen C4-Pflanzen z.B. Mais, in einer Zelle abläuft und das Leben der Pflanze unter solchen Physiologischen Bedingungen sichert. Die in dieser Arbeit eingesetzten Gene zum aufbauen des modifizierenden Biosyntheseweges sind: Phosphoenolpyruvat Carboxylase (PEPC) aus Hydrilla verticillata; NAD-Malat-Dehydrogenase (MDH) aus Mais; NAD-Malic Enzym (ME) aus E. coli; Lactat-Dehydrogenase (LdhA) aus Mausleber; Lactat-Dehydrogenase (LdhB) aus Ratenherz; Phosphoenolpyruvat Synthase (PPS) aus E. coli; Malat-Lactat Antiporter (Mle) aus B. subtilis. Alle Gene wurden erfolgreich mit der Gateway Methode in ein Plasmid integriert und in Pflanzen übertragen. Die Aktivität aller Enzyme wurde gemessen. Leider zeigte sich, dass die gezielte Strategie nicht zu dem gewünschten Erfolg führt. Das hat wohl verschiedene Gründe: i) Obwohl alle Gene einen Lichtinduzierten Promoter tragen, konnte keine koordinierte Genexpression erhalten werden. Alle Gene wurden zwar exprimiert, die Expressionsraten und damit die Enzymaktivität sind aber sehr unterschiedlich und variieren von Pflanze zu Pflanze. ii) Die in H. verticillata zweifellos vorhandene Regulation der Enzymaktivitäten konnte nicht imitiert werden. iii) Wir wissen noch zu wenig über die Regulation von Genexpression und Enzymaktivität in C4-Hydrilla Pflanzen. Die CO2-Konzentration in C3-Landpflanzen ist höher als in der submers lebenden H. verticillata. Der H. verticillata C4 CO2 Fixierungsmechanismus ist daher möglicherweise auf C3-Landpflanzen nicht übertragbar. Die zweite potentielle Möglichkeit zur Erreichung des Ziels bestand darin, den sogenannten MMPEM-Biosyntheseweg in C3-Pflanzen zu übertragen. Diese Strategie wurde nach intensiven Diskussionen kreiert. Die beteiligten Enzyme sind: Malat-Synthase (MS) aus E. coli; NAD-Malic Enzym (ME) aus E. coli; Phosphoenolpyruvat-Synthase (PPS) aus E. coli; Enolase (E) aus E. coli; Phosphoglycerat-Mutase (PGM) aus E. coli. Alle Gene wurden mit Hilfe der Gateway-Technologie erfolgreich in N. tabacum Pflanzen übertragen, die den sogenannten GT-DEF Biosyntheseweg enthielten. Der GTDEF-Patway führt zu einer Erhöhung der CO2-Fixierung in C3-Pflanzen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der zusätzliche Einbau des MMPEP-Stoffwechselweges zu einer weiteren Erhöhung der CO2 Fixierung führt. Der gewählte Ansatz war also erfolgreich. In späteren Arbeiten sollte versucht werden, den Effekt beider Photosynthesewege (GTDEF/MMPEM) sowie des MMPEM-Einzelweges zu erhöhen. Das kann mit Hilfe der klassischen Gentechnik erreicht werden. Sowohl durch eine stabile Koordination der Genexpression als auch durch eine besser abgestimmte Aktivität der Enzyme. In Freilandversuchen muss dann gezeigt werden, ob transgene Pflanzen verglichen mit Wildtyp-Pflanzen mehrt Biomasse auf der gleichen Fläche produzieren können.

The present study shows an improvement in photosynthesis in C3 plants by two different approaches. The first approach is aimed to increasing the CO2 concentration in the proximity of Rubisco. The second approach is aimed at bypassing the ‘wasteful’ reaction of photorespiration in C3 plants. In both approaches, multiple transgene metabolic pathways are created and successfully introduced in C3 plants. With the help of multiple transgene metabolic pathways the final products such as CO2 is observed to successfully reach Rubisco. The multiple transgenes are introduced into the tobacco (Nicotiana tabacum) plant through Agrobacterium transformation. The MultiRound Gateway technology is used to successfully deliver the combination of two multiple transgene pathways in to the Agrobacterium. The first approach is intended to create a single cell C4 pathway in a C3 plant, similar like in Hydrilla verticillata C4 plants, Novel pathway (HC4l) mimic Hydrilla in which carbon channels from cytoplasm to chloroplast ultimately resulting in an increase of CO2 under the vicinity of Rubisco. In this approach, to create the first multigene transgenic pathway, seven different heterologaus enzymes are used. They are: phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) derived from Hydrilla verticilliata, NAD malate dehydrogenase (MDH) derived from Maize, NAD malic enzyme (ME) derived from E. coli, lactate dehydrogenase (LDHA) derived from mouse liver, lactate dehydrgenase (LDHB) derived from rat heart, phosphoenolpyruvate synthase (PEPS) from E. coli, and malate lactate antiporter (Mle) derived from Bacillus subtilitis. The MultiRound Gateway technology is successfully used to transfer these seven transgenes in to plant with the help of two entry vector and one destination vector approach. The RT-PCR is used to quantify the expression level and the efficiency of the expression of transgenes in the study plant. The findings from the RT-PCR indicate successful expression of transgenes in the test plants. The enzymes of respective transgenic are analyzed with enzymatic assays and it also reveals the presence of active protein in the plant studied. In the second approach, another combination of transgenic pathway is introduced into C3 plants to bypass the wasteful reaction and flux of photorespiration. The transgenic pathway used in this approach included genes such as malate synthase (MS) from E. coli, NAD malic enzyme (ME) from E. coli, phosphoenolpyruvate synthase (PPS), enolase from E. coli and phosphoglycerate mutase (PGM) from E. coli. The aim of this transgenic pathway is to reduce the photorespiration to a greater degree than previously observed in plants with GTDEF pathway. The plants used for this approach already possessed the GTDEF pathway. Similar to the first approach, the MultiRound Gateway technology is used to transfer all transgenes by using two entry and one destination vector. The analysis by enzyme assays shows the active presence of the test proteins the plant studied. The influence of introduction of five genes pathway in a plant is measured through physiological, biochemical and by photosynthetic parameters. Metabolism of glycolate pathway derived from E. coli and was established in the chloroplast of Arabidopsis thaliana plants (Kebeish et al., 2007). This pathway (GTDEF) showed lower compensation point, higher glucose, fructose and end product of the photosynthesis as compared to the wild type plants. The present study reveals that the introduction of the novel pathway consisting five genes (MMPEM pathway) into the plants existing GTDEF pathway results in further decrease in the compensation point (Г*), a noticeable increase in glucose, fructose and other end product of photosynthesis. The study also reveals that the plants with combination of GTDEF pathway and five gene pathway has higher fresh as well as dry weight as compared to plants with only GTDEF pathway. The research shows that with the successful introduction of multigene complex metabolic pathways in C3 plants, the higher rate of photosynthesis is possible.

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