Analoga des S-Adenosyl-l-methionins zur gezielten Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen durch Methyltransferasen

Martin, Michael; Weinhold, Elmar

doi:32602

Analoga des S-Adenosyl-l-methionins zur gezielten Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen durch Methyltransferasen = Analagues of S-Adenosyl-l-methionine for the targeted labeling of nucleic acids and proteins by methyl transferases

Martin, Michael (Author)

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michael Martin

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangXII, 128 S. : Ill.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-05-07

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-45702
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/229839/files/4570.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNA-Methyltransferase (Genormte SW) ; Adenosylmethionin (Genormte SW) ; AdoMet (Genormte SW) ; Alkinylierung (Genormte SW) ; Photovernetzung (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; Selen-Analoga (frei) ; Se-Adenosyl-l-selenomethionin Analoga (frei) ; Einstufige Reporterstrategie für Nukleinsäuren (frei) ; Sequenzspezifische Alkinylierung von Nukleinsäuren und Proteinen (frei) ; Sequenzspezifische Modifizierung von DNA (frei) ; Photovernetzung von MTasen mit DNA (frei) ; Se-Adenosyl-l-selenomethionine analogues (frei) ; one-stage reporter strategy for nucleic acids (frei) ; sequence-specific alkynylation of nucleic acids and proteins (frei) ; sequence-specific modification of DNA (frei) ; photocrosslinking of MTases with DNA (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
In der vorliegenden Dissertation wurden neue Analoga des natürlichen Cofaktors S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) synthetisiert und in biologischen Versuchen die Aktivität von DNA- oder Protein-Methyltransferasen (MTasen) mit diesen Cofaktor-Analoga getestet. Die neuen Cofaktor-Analoga tragen statt der Methylgruppe andere Seitenketten mit funktionellen Gruppen. In drei Cofaktor-Analoga wurde auch das Sulfoniumzentrum gegen ein Selenoniumzentrum ausgetauscht. Insgesamt wurden 15 neue Cofaktoren mit 12 neuen Seitenketten hergestellt. Es wurde ein stabiler doppeltaktivierter Cofaktor entwickelt, der eine endständige Alkingruppe trägt, die durch MTasen sequenzspezifisch auf DNA, RNA und Proteine übertragen werden kann. Durch die Kleinheit der Seitenkette wird der Cofaktor von einer Vielzahl von MTasen akzeptiert. Der Austausch von Schwefel gegen Selen bringt eine deutliche Aktivitätssteigerung, da das Selen-Analogon nach einem anderen – langsameren – Mechanismus inaktiviert wird als sein Schwefel-Analogon. Dies ist bei der zweistufigen sequenzspezifischen Markierung von Biomolekülen sehr hilfreich. Daneben wurden andere AdoMet-Analoga mit weiteren funktionellen Gruppen (Azide, Alkene, Amine) hergestellt, die sich ebenfalls für das zweistufige Markierungsverfahren eignen. Des Weiteren wurde ein Cofaktor synthetisiert, dessen übertragbare Gruppe (ein aromatisches Azid) durch Bestrahlen mit UV-Licht eine kovalente Bindung mit dem aktiven Zentrum der übertragenden DNA-MTase bildet. Das Ziel, einen kovalenten MTase-Substrat-Komplex mit gebundener Cofaktorseitenkette zu erzeugen und diesen durch Elektromobilitätstests nachzuweisen, wurde mit zwei DNA-MTasen erreicht. Dabei ist die Ausbeute der Photovernetzung mit diesem Cofaktor ebenso wie die Aktivität von DNA-MTasen überdurchschnittlich hoch. Cofaktoren mit aromatischen Seitenketten eignen sich auch um den Übergangszustand während der enzymatischen Modifikationsreaktion näher zu erforschen. Im letzten Abschnitt wurden zwei AdoMet-Analoga mit unterschiedlich langen Linkern entwickelt, die ein Reportermolekül, Biotin, in einem Schritt auf DNA übertragen. Dies war bis zu diesem Zeitpunkt nur in zwei aufeinander folgenden Schritten möglich. Die Cofaktoren, die Biotin in der Seitenkette tragen, wurden hinsichtlich Syntheseausbeute und Aktivität mit DNA-MTasen verglichen. Das erfolgreiche Übertragen von Biotin auf DNA wurde in Elektromobilitäts-Verschiebungs-Tests durch die Wechselwirkung mit Streptavidin nachgewiesen. Im Prinzip können beliebige Reportermoleküle durch Klickchemie bzw. durch Bilden einer Amidbindung gebunden werden, sodass die Bibliothek der Cofaktoren für einstufige Markierungsverfahren schnell erweitert werden kann.

In the present dissertation new analogues of the natural cofactor S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) were synthesized and the activity of DNA- or protein methyl transferases (MTases) were testet in biological experiments. The new cofactor-analogues carry other side chains with functional groups instead of the methyl group. In three cofactor-analogues the sulfonium center was replaced by a selenonium center as well. In total 15 new cofactors with 12 new side chains were manufactured. A stable double-activated cofactor was developed which carries a terminal alkyne moiety that can be transferred sequence-specifically by MTases onto DNA, RNA and proteins. Because of the shortness of the side chain the cofactor is being accepted by a multitude of MTases. The replacement of sulfur against selenium results in a considerable increase of activity since the selenium analogue is inactivated by another and slower mechanism than its sulfur analogue. This is highly advantageous for the two-stage sequence-specific labeling of biomolecules. Aside other analogues of AdoMet with further functional groups (azides, alkenes, amines) which are suitable as well for the two-stage labeling procedure were manufactured. Furthermore a cofactor was synthesized whose transferable group (an aromatic azide) generates a covalent bond with the active site of the transfering DNA-MTase through irradiation of UV light. The goal to produce a covalent MTase-substrate complex with bound cofactor side chain and to provide evidence for it by electro mobility tests was achieved with two DNA-MTases. The yield of the photo crosslinking with this cofactor as well as the acitivity of DNA-MTases is higher-than-average. Cofactors with aromatic side chains are also suitable to elucidate more closely the transition state during the enzymatic modification reaction. In the last section two AdoMet analogues with different linker lengths were developed which transfer a reporter molecule, biotin, in a one-stage process onto DNA. This was possible only in two consecutive steps until this point of time. The cofactors which carry biotin in the side chain werde compared to each other regarding synthesis yield and acitivity with DNA-MTases. The successful transfer of biotin onto DNA was proved in electromobility-shift-assays through the interaction with streptavidin. In principle arbitrary reporter molecules can be attached using click chemistry or the formation of an amide bond respectively so that the library of cofactors for one-stage labeling processes can be extended rapidly.

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