Super-specific DNA methylation by a DNA methyltransferase coupled with a triple helix-forming oligonucleotide

Maluszynska-Hoffman, Maria; Weinhold, Elmar

doi:29412

Super-specific DNA methylation by a DNA methyltransferase coupled with a triple helix-forming oligonucleotide = Super-specifische DNA methylierung von einer DNA Methyltransferase gekuppelt mit einem Triple-Helix bildenden Oligonucleotid / vorgelegt von Maria Maluszynska-Hoffman

Maluszynska-Hoffman, Maria (Author)

2008

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangIV, 104 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-11-13

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-28545
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/51122/files/Maluszynska_Hoffman_Maria.pdf

Einrichtungen

Fachgruppe Chemie (150000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNS-Methyltransferase (Genormte SW) ; DNS-Doppelstrangbruch (Genormte SW) ; Gentherapie (Genormte SW) ; Methylierung (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; C5-DNA-Methyltransferase (frei) ; TFO (frei) ; triple helix (frei) ; gene therapy (frei) ; super-specific methylation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
In dieser Arbeit wurde die prokariotische DNA-Cytosin-C5 Methyltransferase (MTase) M.SssI mit einem Triple-Helix bildenden Oligonukleotid (TFO) gekuppelt und die Eigenschaften von dem Konjugat wurden in verschiedenen biochemischen und biophysikalischen Methoden untersucht. M.SssI besitzt die selbe Erkennungssequenz wie die DNA-MTasen von Säugetieren und durch das gekuppelte TFO sollte eine bestimmten Sequenz innerhalb eines Genoms adressiert werden. Die Zielsequenz entspricht der Promotorregion von EpCAM, das in vielen Karzinomen überexprimiert wird und an der Karzinogenese teilnimmt. Diese Strategie könnte in einer Gentherapie Verwendung finden. Drei M.SssI-Varianten wurden spezifisch mit dem TFO konjugiert, entweder durch bifunctional crosslinking oder expressed protein ligation (EPL). Nur ein Konjugat wurde weiter untersucht, um das Ziel Super-specifische TFO-dirigierte DNA-Methylation zu erreichen. M.SssI(C141S) wurde durch eine bekannte Maleimid-basierende heterobifunktionelle Crosslinking Methode mit dem ausgewählten TFO gekuppelt. Bei M.SssI(C141S) handelt es sich um eine Mutante, bei welcher das katalytische Cystein durch ein Serine ersetzt wurde. Das M.SssI, das mehrere Cystein Reste hat, wurde ähnlich an das TFO gekuppelt, aber nachdem das active site Cystein (C141) reversiebel blockiert wurde. Die Blockierung schützt das katalitische Cystein und verhindert die Deaktivierung des Proteins beim Crosslinking. Des weiteren wurde die M.SssI(Q147L) Variante mit TFO durch EPL gekuppelt. Wegen geringer Reaktionsausbeute (kleiner 10%) wurde diese Methode nicht mehr benutzt um M.SssI-TFO Konjugate zu erstellen. Die Spezifität von M.SssI(C141S)-TFO Konjugat wurde in einem in vitro Methylation Test geprüft. Die Resultate haben eine hohe, gezielte und wenige, unadressierte DNA Methylierung gezeigt. Die thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften von der Triple-Helix Bildung wurden analysiert. Das ausgewählte TFO ist ein Polypyrimidin-reicher Strang und bindet parallel zu dem Polypurin Strang der Duplex DNA. Die Magnesium Konzentration beeinflusst die Triple Helix Formation, was mit DNA Schmelzen untersucht wurde. Die DNA Bindungsaffinität von M.SssI(C141S) und M.SssI(C141S)-TFO wurde in einem 2-Aminopurin (2Ap) Fluorescenz Experiment gemessen, wobei das M.SssI(C141S)-TFO Konjugat reduzierte DNA Bindungsaffinität gezeigt hat. Wenn aber ein anderes DNA Substrat eingesetzt wurde, welches neben der Ziel-Sequenz eine TFS-Sequenz hatte, wurde die DNA Bindung des Enzymes (von dem M.SssI(C141S)-TFO Konjugat) teilweise wiederhergstellt. Der wichtigste Gen Expression Effekt von der spezifisch methylierten 5’-CG-3’ Sequenz durch das M.SssI(C141S)-TFO Konjugat wurde in einem Transfektionsexperiment untersucht. SKOV3 Zellen wurden mit dem Plasmid p39E, welches durch das Konjugat methyliert wurde, transfiziert. Das p39E hat die EpCAM Promoter Sequenz vor dem GFP Gen. Spezifische Methylation des EpCAM Gens setzt die GFP Expression runter auf 35% im Vergleich zu dem komplett methyliertem Plasmid.

In this work, an engineered variant of the DNA cytosine-C5 methyltransferase (MTase) M.SssI has been conjugated with a triple helix-forming oligonucleotide (TFO) and the properties of the enzyme-TFO conjugate were evaluated using a variety of biochemical and biophysical methods. M.SssI is the only known prokaryotic DNA MTase which shares the 5’-CG-3’ recognition sequence (CpG) with mammalian DNA MTases. It has been rendered a super-specific MTase by conjugation with a TFO designed to bind a triple helix-forming site (TFS) in the promoter of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) with high specificity and affinity. This transmembrane glycoprotein is strongly overexpressed in several carcinomas and its expression levels have been shown to correlate with the EpCAM promoter methylation status (van der Gun et al., 2008). EpCAM down-regulation via sequence-specific DNA methylation could find potential application in gene therapy. Three M.SssI variants have been selectively conjugated with DNA single strand, either by bifunctional crosslinking or expressed protein ligation (EPL). Only one conjugate has been further investigated, as a tool for super-specific TFO-directed DNA methylation. M.SssI(C141S) has been conjugated with the chosen TFO using a well known maleimide based bifunctional crosslinking method. In M.SssI(C141S), the catalytic cysteine has been replaced with serine and thus it possesses only one C-terminal cysteine residue, which can be crosslinked with the TFO via a long polyethylaene linker (Mal-PEG27-TFO). Wild type M.SssI, which possesses more than one cysteine residue, has been coupled with an oligodeoxynucleotide (ODN) also by heterobifunctional crosslinking, but in a longer synthetic route featuring the temporary protection of the active site cysteine (C141). Coupling with catalytic cysteine could lead to a loss of DNA MTase activity. Therefore, trapping and subsequent conjugation reaction was analyzed and the desired C-terminally ODN-linked conjugate could be purified by anion exchange HPLC. However, the obtained overall yield was 2%, which excluded this approach to obtain larger amounts of M.SssI-ODN conjugate from further investigations. Trapping M.SssI is a good way to temporally block the catalytic cysteine residue, but can be applied only to variants displaying good binding properties. Isolating the formed trapping complex can be also seen as a selection of the catalytically active M.SssI molecules and way to determine the amount of active enzyme in the preparation. This approach, despite a very low yield, enabled conjugation and purification of an ODN-conjugate with catalytically active M.SssI. Such discrimination is infrequent in DNA-protein coupling methods. Finally, coupling of the low binding variant M.SssI(Q147L) with the TFO was carried out by EPL. Coupling of M.SssI(Q147L)-thioester with the TFO was analyzed by SDS-PAGE and resulted in 10% conversion. Applying EPL for producing the M.SssI(Q147L)-TFO conjugate was not successful in terms of high conversion. This and high precipitation levels reduced the usefulness of this method for producing M.SssI(Q147L)-TFO conjugate in an amount needed for testing TFO-directed super-specific DNA methylation in vitro. The specificity of M.SssI(C141S)-TFO conjugate obtained by heterobifunctional crosslinking has been tested in an in vitro methylation assay on Litcon54. The results showed super-specific DNA methylation of the targeted site and that background DNA methylation levels were only slightly elevated even in the sample with the highest conjugate excess. In parallel the thermodynamic and kinetic properties of triple helix formation were studied. The chosen TFO is a polypyrimidine T-rich strand, which binds in a parallel orientation to the polypurine strand of the duplex DNA. The influence of magnesium on triple helix formation was analyzed by thermal denaturation. In addition, the FRET assay was used to confirm the binding orientation of the TFO to the TFS. The kinetics of triple helix formation were analyzed in the UV assay. DNA binding affinity of M.SssI(C141S) and M.SssI(C141S)-TFO was investigated in the 2-aminopurine (2Ap) fluorescence assay, where the M.SssI(C141S)-TFO conjugate displayed a much reduced DNA binding. Yet, when a DNA substrate with the TFS sequence next to the target site was investigated, the DNA binding of the enzyme within the M.SssI(C141S)-TFO conjugate could be significantly restored. The imposing effect of a single methylated 5’-CG-3’ sequence by M.SssI(C141S)-TFO conjugate on gene expression was shown in transfection experiments. SKOV3 cell were transfected with a conjugate-treated reporter plasmid p39E, possessing the EpCAM promoter sequence upstream of the green fluorescent protein (GFP) gene. Selective methylation resulted in GFP expression down-regulation of 35% compared with the fully methylated plasmid.

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