Untersuchungen zur metabolismus-bedingten Insektizid-Resistenz von Drosophila melanogaster als Beispiel für den Einsatz Cytochrom P450-transgener Zellsuspensionskulturen von Nicotiana tabacum zur Aufklärung der enzymatischen Kapazität des Ursprungsorganismus

Joußen, Nicole; Schuphan, Ingolf

doi:28807

Untersuchungen zur metabolismus-bedingten Insektizid-Resistenz von Drosophila melanogaster als Beispiel für den Einsatz Cytochrom P450-transgener Zellsuspensionskulturen von Nicotiana tabacum zur Aufklärung der enzymatischen Kapazität des Ursprungsorganismus = Investigations on the metabolism-based insecticide resistance of Drosophila melanogaster as example for the use of cytochrome P450-transgenic cell suspension cultures of Nicotiana tabacum for the elucidation of the enzymatic capacity of the donor organism

Joußen, Nicole

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nicole Joußen

ImpressumMünchen : Hut 2008

UmfangVI, 243 S. : Ill., graph. Darst.

ISBN978-3-89963-746-5

ReiheBiologie

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schuphan, Ingolf (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-04-10

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-24012
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51305/files/Joussen_Nicole.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Taufliege (Genormte SW) ; Cytochrom P-450 (Genormte SW) ; Heterologe Genexpression (Genormte SW) ; Gerste (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Insektizid-Resistenz (frei) ; Tabak-Zellsuspensionskulturen (frei) ; Metabolismusstudien (frei) ; insecticide resistance (frei) ; Drosophila melanogaster (frei) ; cytochrome P450 monooxygenase (frei) ; heterologous expression (frei) ; tobacco cell suspension cultures (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Mit dem weltweiten Gebrauch von Insektiziden steigt die Anzahl resistenter Insekten-Spezies, wodurch die Effektivität von Pestiziden verringert und das menschliche Wohlergehen durch Ernteausfälle und Krankheitsausbreitungen bedroht wird. Einige Insektizide sind in der Umwelt in ausreichender Konzentration vertreten, so dass sogar Populationen von Nicht-Zielorganismen Resistenzen entwickelt haben. Dazu gehören Cyp6g1-überexprimierende Stämme von Drosophila melanogaster Meig., die gegenüber einem weiten Spektrum unterschiedlicher Insektizide, einschließlich DDT (Dichlordiphenyltrichlorethan) und Imidacloprid, resistent sind. Bis jetzt gab es keinen Nachweis, dass die Cytochrom P450-Monooxygenase CYP6G1 in der Lage ist, Insektizide zu metabolisieren. Dies sollte anhand von Imidacloprid, DDT und Methoxychlor durch heterologe Expression des Cyp6g1 in Zellsuspensionskulturen von Nicotiana tabacum L. als geeignetes in vitro-System untersucht werden. Die dazu notwendigen Vektoren mit der cDNA des Cyp6g1 und für weitere Studien bestimmte Vektoren mit der cDNA des Cyp71u4v2 (Gerste) bzw. des Cyp3a4 (human) wurden hergestellt, die Zellkulturen transformiert und molekularbiologisch untersucht. Es wurde gezeigt, dass CYP6G1 in der Lage ist, die eingesetzten (14C-markierten) Insektizide zu metabolisieren. Die Cyp6g1-transgene Kultur 6L setzte in 48 h 400 µg Imidacloprid bei einem absoluten Umsatz von 86% zu 60% 4-Hydroxyimidacloprid, 20% 5-Hydroxyimidacloprid, 7% olefinischem Imidacloprid und geringen Mengen an 4,5-Dihydroxyimidacloprid um (kein detektierbarer Umsatz der nicht-transgenen Kultur LS). In weiterführenden Studien wurde der CYP6G1-bedingte Metabolismusweg von Imidacloprid aufgeklärt und gezeigt, dass die Entstehung des olefinischen Metaboliten auf einen Einfluss des säurehaltigen Mediums zurückzuführen war. Durch den zeitgleichen Einsatz von Piperonylbutoxid (200 µg), einem P450-Inhibitor, konnte der CYP6G1-bedingte Metabolismus von Imidacloprid (20 µg, 24 h) um 82% inhibiert werden. Nur unter anaeroben Bedingungen in einem geschlossenen System wurde DDT (20 µg) in 48 h neben geringen Mengen möglicher weiterer Metaboliten durch eine reduktive Dechlorierung zu 16% DDD (Dichlordiphenyldichlorethan) (in einer Parallele) bei einem absoluten Umsatz von 37% umgesetzt. Dieses Ergebnis war allerdings nur bedingt reproduzierbar. In der LS-Kultur wurden im geschlossenen System bei einem absoluten Umsatz von 11% nur 2% DDD detektiert. Methoxychlor (45,8 µg) wurde in der 6L-Zellkultur in 24 h bei einem absoluten Umsatz von 96% zu 17% Catechol-Methoxychlor, 16% Trishydroxymethoxychlor, 8% Bishydroxymethoxychlor und 6% Monohydroxymethoxychlor umgesetzt. Im Gegensatz zu den Studien mit Imidacloprid und DDT wies die LS-Kultur bei Methoxychlor einen hohen absoluten Umsatz von 62% auf. Trotzdem konnten 34% des Umsatzes und vor allem die erhöhte Bildung von Trishydroxymethoxychlor und Catechol-Methoxychlor auf die enzymatische Aktivität des CYP6G1 zurückgeführt werden. Auch bei Methoxychlor war es möglich durch die zeitgleiche Gabe von Piperonylbutoxid (458 µg) in der 6L-Kultur den absoluten Umsatz um 43% und in der LS-Kultur um 92% zu inhibieren. Der Anteil an Glycosiden sank durch diese Behandlung, so dass der Anteil an Primärmetaboliten stieg. Die Metabolismuskapazität des CYP6G1 führte zu einer Detoxifikation der verschiedenen Insektizide gegenüber Drosophila. Somit konnte erstmals die Lücke zwischen dem vermuteten Resistenz-Gen Cyp6g1 und dem beobachteten Resistenzphänomen durch den Nachweis geschlossen werden, dass CYP6G1 zumindest fähig ist, drei Insektizide zu metabolisieren. Es sollte erwähnt werden, dass CYP6G1 vermutlich nicht alleine für die Resistenz gegenüber DDT verantwortlich ist, aber wahrscheinlich Resistenz gegenüber Methoxychlor vermittelt. Mit 4-n-Nonylphenol wurde schließlich ein Substrat des bei einer Pathogenabwehrreaktion der Gerste gefundenen CYP71U4v2 identifiziert. Die Cyp71u4v2-transgene Kultur bildete bei einem absoluten Umsatz von 93% die Hauptmetaboliten 4’-Hydroxy-4-n-nonylphenol und 5’-Hydroxy-4-n-nonylphenol. In der nicht-transgenen Kultur wurde ein ebenfalls hoher absoluter Umsatz von 60% detektiert. Allerdings unterschied sich das Muster der Seitenketten-hydroxylierten Metaboliten mit dem Hauptmetaboliten 8’-Hydroxy-4-n-nonylphenol deutlich von dem der transgenen Kultur, so dass die enzymatische Aktivität des CYP71U4v2 eindeutig nachgewiesen wurde. Ein Umsatz dieses Abbauprodukts von Nonylphenolpolyethoxylaten, die früher als Formulierungshilfsstoffe in Pestiziden verwendet wurden, durch endogene Enzyme kann für Gerste durchaus relevant sein. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass es sich bei der Tabak-Zellsuspensionskultur um ein geeignetes Expressionssystem für P450-Gene unterschiedlichen Ursprungs handelt, bei dem auf die zeitgleiche Expression der zugehörigen P450-Reduktase verzichtet werden kann und das die Aufklärung bzw. Vorhersage Metabolismus-bedingter Resistenzphänomene ermöglicht.

With the worldwide use of insecticides, the number of resistant insect species increases resulting in decreased efficacy of pesticides and threat of human welfare by crop failures and disease transmission. Environmental concentrations of some insecticides are so high that even populations of non-target organisms are selected for resistance. Thus, Cyp6g1-overexpressing strains of Drosophila melanogaster Meig. were selected; they are resistant to a wide range of diverse insecticides, including DDT (dichlorodiphenyltrichloroethane) and imidacloprid. Up to now however, no evidence has been available that the cytochrome P450 monooxygenase CYP6G1 is able to metabolise insecticides. This should be studied regarding imidacloprid, DDT, and methoxychlor by heterologous expression of Cyp6g1 in cell suspension cultures of Nicotiana tabacum L. as convenient in vitro system. The required vectors with cDNA of Cyp6g1 and vectors with cDNA of Cyp71u4v2 (barley) and Cyp3a4 (human) for additional studies, were constructed, tobacco cells were transformed and studied by molecular biology. It was demonstrated, that CYP6G1 is capable of metabolising the (14C-labelled) insecticides. Cyp6g1-transgenic culture 6L converted 400 µg imidacloprid within 48 h to 60% of 4-hydroxyimidacloprid, 20% of 5-hydroxyimidacloprid, 7% of olefinic imidacloprid and minor amounts of 4,5-dihydroxyimidacloprid with an absolute metabolic rate of 86% (no detectable turnover in the non-transgenic culture LS). In supplementary studies, the metabolic pathway of imidacloprid derived from CYP6G1 was elucidated, and it was shown that the appearance of the olefinic metabolite was traced back to the influence of the acidic media. After simultaneous application of P450 inhibitor piperonyl butoxide (200 µg), the CYP6G1-dependent metabolism of imidacloprid (20 µg, 24 h) was inhibited by 82%. DDT (20 µg) was only converted under anaerobic conditions in a closed system within 48 h by reductive dechlorination to 16% DDD (dichlorodiphenyldichloroethane) (in one parallel) besides low amounts of possible further metabolites with an absolute metabolic rate of 37%. However, this result showed only a limited reproducibility. In the LS culture only 2% DDD were detected in the closed system with an absolute metabolic rate of 11%. Methoxychlor (45.8 µg) was converted to 17% of catechol methoxychlor, 16% of trishydroxymethoxychlor, 8% of bishydroxymethoxychlor, and 6% of monohydroxymethoxychlor in the 6L cell culture within 24 h (absolute metabolic rate: 96%). In contrast to studies with imidacloprid and DDT, LS culture showed a high absolute metabolic rate of 62% regarding methoxychlor. Nevertheless, 34% of the metabolic rate and especially the increased formation of trishydroxymethoxychlor and catechol methoxychlor could be traced back to the enzymatic activity of CYP6G1. Similarly, the absolute metabolic rate of methoxychlor in 6L and LS culture was inhibited by 43% and 92%, respectively, after simultaneous application of piperonyl butoxide (458 µg). Due to this treatment, the glycoside fraction decreased in favour of primary metabolites. The metabolic capacity of CYP6G1 leads to detoxification of different insecticides towards Drosophila. Thus, the gap between the supposed resistance gene Cyp6g1 and the observed resistance phenomenon was closed by the evidence that CYP6G1 is at least able to metabolise three insecticides. It should be mentioned that CYP6G1 is presumably not alone responsible for the resistance towards DDT but confers probably resistance towards methoxychlor. Using 4-n-nonylphenol, a substrate of CYP71U4v2, which was shown to be overexpressed in barley during pathogen defence, was finally identified. Cyp71u4v2-transgenic culture formed the main metabolites 4’-hydroxy-4-n-nonylphenol and 5’-hydroxy-4-n-nonylphenol with an absolute metabolic rate of 93%. In the non-transgenic culture, a high metabolic rate of 60% was also detected. However, the pattern of side chain hydroxylated metabolites with the main metabolite 8’-hydroxy-4-n-nonylphenol differed obviously from that of the transgenic culture – thus clearly proving the enzymatic activity of CYP71U4v2. The turnover of the degradation product of nonylphenol polyethoxylates formerly used in pesticide formulations by endogenous enzymes could be quite relevant for barley. The present work showed that the tobacco cell suspension culture is a convenient expression system for P450 genes of diverse origin enabling to elucidate or predict metabolism-based resistance phenomena without the need of expression of appropriate P450 reductase.

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