Metabolismus von 14 C-Methoxychlor in humanen P450- transgenen und nicht-transgenen Pflanzenzellkulturen zur Produktion endokrin-wirksamer Metaboliten sowie deren Untersuchung auf östrogene Wirkung

Breuer, Maren Anne; Schuphan, Ingolf

doi:3081

Metabolismus von 14 C-Methoxychlor in humanen P450- transgenen und nicht-transgenen Pflanzenzellkulturen zur Produktion endokrin-wirksamer Metaboliten sowie deren Untersuchung auf östrogene Wirkung = Metabolism of 14C-Methoxychlor in Human P450 Transgenic and Non transgenic plant cell suspension cultures to produce endocrine active metabolites and determine their endocrine potential

Breuer, Maren Anne

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Maren Anne Breuer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangV, 175 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schuphan, Ingolf (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-11-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-30811
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51497/files/Breuer_Maren.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Insektizid (Genormte SW) ; Endokrin wirksamer Stoff (Genormte SW) ; Cytochrom P-450 (Genormte SW) ; Enantiomere (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Methoxychlor (frei) ; CYP3A4 (frei) ; CYP2C19 (frei) ; Pflanzenzellsuspensionskultur (frei) ; plant cell suspension culture (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Am Beispiel des östrogen aktiven Organochlor-Insektizids 14C-Methoxychlor (MXC) sollte der Einsatz von (P450-transgenen) Pflanzenzellsuspensionskulturen zur Untersuchung der Metabolisierbarkeit von Umweltschadstoffen dargestellt werden. Im Vordergrund standen dabei die Untersuchung des Metabolismus und der östrogenen Wirksamkeit der Testsubstanz und deren Umwandlungsprodukte durch umweltanalytische Methoden (Radio-DC, Radio-HPLC, GC-(MS), 1H-NMR) und einem Biotest (YES-Test). Im Hinblick auf den Metabolismus war die Untersuchung von Umsatzraten und Metaboliten-Profilen in Daucus carota (Dc), Nicotiana tabacum (Nt), Glycine max. (Gm) und Triticum aestivum (Ta) und transgenen Kulturen von Karotte (2DcC19, 3DcA4) und Tabak (1NtA1, 1NtA2, 3NtA4, 2NtC19, 2NtB6) von Interesse. Lösliche Metaboliten wurden durch Co-Chromatographie identifiziert und quantifiziert. Da es sich bei MXC um eine prochirale und proöstrogene Verbindung handelte, wurden die R/S-Enantiomere der entsprechenden Metaboliten getrennt und einzeln analysiert. Eine neu etablierte Zellsuspensionskultur von Daucus carota wurde durch Agrobakterien-vermittelte Transformation separat mit der cDNS der humanen P450-Isoformen Cyp2c19 und Cyp3a4 ausgestattet (2DcC19, 3DcA4). Die erfolgreiche Transformation wurde durch PCR und den Nachweis der entsprechenden mRNS verifiziert. Das Wachstum aller neuen Kulturen wurde durch die Ermittlung von Wachstumsparametern kontrolliert. Das 3-fach demethoxylierte Derivat von MXC wurde als Referenzverbindung synthestisiert. Durch Metabolismusstudien konnte gezeigt werden, dass Dc, Nt, Gm und Ta durch endogene enzymatische Kapazitäten in der Lage waren, MXC mit Umsatzraten von 87,3%, 71,3%, 26,1% und 41,7% zu metabolisieren (DC nach Hydrolyse). In den Gm- und Ta-Kulturen wurde mono-OH-MXC zu 4,8% bzw. 5,4% nachgewiesen; tris-OH-MXC zu 5,9% bzw. 5,5%. In der Nt-Kultur konnten 10,3% bis-OH-MXC und 13,8% tris-OH-MXC nachgewiesen werden. Der am stärksten vorhandene Metabolit im Zellextrakt (ZE) der Dc-Kultur war mono-OH-MXC mit 18,8%, gefolgt von bis-OH-MXC mit 9,2% und tris-OH-MXC mit 4,6%. Während die Ergebnisse der Metabolismusstudien mit den 3DcAa4- Kulturen uneinheitlich verblieben, war die Umsatzrate der 2DcC19-Kultur ca. 10% niedriger als die der untransformierten Kultur. In Metabolismusstudien mit Nt, 1NtA1, 1NtA2 und 3NtA4 war von 24 h auf 72 h für alle Kulturen eine Abnahme von MXC festzustellen; mono-OH-MXC nahm ebenfalls in allen Kulturen ab. Außer in der 3NtA4-Kultur nahmen die Anteile an bis-OH-MXC in allen Kulturen zu. Während nach 24 h in keiner der Kulturen tris-OH-MXC nachzuweisen war, konnte dieses nach 72 h in allen Kulturen nachgewiesen werden. Eine mit 2NtB6-Kulturen durchgeführten Metabolismusstudie zeigte, dass MXC innerhalb von 24 h bis auf 7,7% umgewandelt worden war, wobei 40,1% Umwandlungsprodukte unbekannter Struktur waren; ca. 20% mono-OH-MXC, ca. 8% bis-OH-MXC und ca. 3,5% tris-OH-MXC. Die Ergebnisse der Metabolismusstudien mit MXC in Cyp2c19-transgenen Zellkulturen von Dc und Nt zeigten für die Karottenkultur mit 87,3% eine Umsatzrate, die um 16% über der der Nt-Kultur lag. Der im Vergleich zur nicht transgenen Kultur um 6,5% höhere Anteil an bis-OH-MXC war vermutlich auf die Aktivität des humanen CYP2C19 zurückzuführen. Die im Rahmen der vorliegenden Metabolismusstudien eingesetzten Pflanzenzellsuspensionskulturen haben sich insgesamt als geeignete in vitro Modellsysteme zur Untersuchung der Metabolisierbarkeit von MXC erwiesen. Die Isoform-Spezifität der humanen P450 hinsichtlich der Metabolitenbildung wurde nachgewiesen. Die Trennung der R/S-Enantiomere erfolgte durch chirale HPLC. mono-OH-MXC und tris-OH-MXC wurden mit Retentionszeitunterschieden von 6,8 min und 13,9 min in ihre Enantiomere getrennt. Für S-mono-OH-MXC wurde ein Drehwinkel von [alpha] 26,589 = +24,1 (c = 1,0, Methanol), für R-mono-OH-MXC ein Drehwinkel von [alpha] 26,589 = -24,1 (c = 1,0, Methanol) bestimmt. Die Enantioselektivität von P450-Isoformen wurde am Beispiel von CYP2C19 und CYP3A4 belegt. Das HPLC-Ergebnis für die 3DcA4-Kulturen zeigte eine sichtbare Aufspaltung des Signals von mono-OH-MXC, was für das Vorhandensein beider Enantiomere sprach. Für die Dc- und 2DcC19-Kultur war nur ein Signal sichtbar. Verglichen mit dem Signal der 3DcA4-Kultur sprach das der 2DcC19-Kultur eher für das S-Enantiomer, wohingegen das der Dc-Kultur sichtbar später eluierte, so dass es sich vermutlich um das R-Enantiomer handelte. Die im YES-Test ermittelte östrogene Potenz von mono-OH-MXC lag im Bereich von 10^ 5 10^-4 g/L, die von bis-OH-MXC im Bereich von 10^-4-10^-3 g/L und die von tris-OH-MXC im Bereich von 10^-3-10^-2 g/L (17ß-Estradiol: 10^-6-10^-8 g/L). Die berechneten EC50-Werte waren 6,64 x 10^-5 g/L für mono-OH-MXC und 1,2 x 10^-5 g/L für bis-OH-MXC. Die östrogene Potenz der R-/S- Enantiomere von mono-OH-MXC lag ungefähr um den Faktor 10 höher als die des Racemats. Miteinander verglichen war die R-Form um den Faktor 10 wirksamer als die S-Form.

Using the estrogenic organochlor insecticide 14C-methoxychlor, the utility of (P450) transgenic plant cell suspension cultures for the determination of the biotransformation of environmental pollutants was investigated in the present study. Research focus was on turnover rates, metabolic profiles and endocrine activity of MXC, including its main metabolites. Analysis was performed using radio-TLC, radio-HPLC and a bioassay (YES). Soluble metabolites were identified and quantified via co-chromatographie. Since MXC is a prochiral and proestrogenic compound, R- and S-enantiomers of corresponding metabolites were separated and examined individually. A carrot cell suspension culture (Dc) was established and transformed separately with cDNA of human Cyp3a4 (3DcA4) and Cyp2c19 (2DcC19) via Agrobacterium tumefaciens. Expression of the P450 genes was succesfully proven by PCR and detection of the corresponding mRNA. The growth of all new cell cultures was monitored by fresh weight, dry weight, conductivity and pH of the media. In addition to the carrot cultures, metabolism studies were performed with soybean (Gm), wheat (Ta) and tobacco cultures (Nt). The latter were also transformed with human P450 isoforms (1NtA1, 1NtA2, 3NtA4, 2NtC19, 2NtB6). The triple demethoxylated derivative of MXC was synthesized as reference substance and its chemical structure was proven by GC-(MS) and 1H-NMR. Metabolism studies showed that all cell cultures had the endogenous enzymatic activity to metabolize MXC. Turnover rates were 87,3% for carrot, 71,3% for tobacco, 26,1% for soybean and 41,7% for wheat (TLC after enzymatic hydrolysis of glycoside conjugates). Regarding metabolic patterns, the non-transformed cultures differed among each other. Whereas mono-OH-, bis-OH- and tris-OH-MXC were found in carrot cultures (18,8%, 9,2% and 4,6%, respectively), only bis-OH-and tris-OH-MXC were detected in tobacco cultures (10,3% and 13,8%, respectively). Amounts of mono-OH-and tris-OH-MXC were nearly the same in soybean and wheat cultures (4,8%, 5,4% mono-OH-MXC and 5,9%, 5,5% tris-OH-MXC, respectively). Whereas the results for Cyp3a4-transgenic cultures remained inconsistent, turnover for the CYP2C19 culture was 10% lower than in the non-transformed culture. Within 24 hours, only 7,7% MXC remained non-metabolized in 2NtB6 cultures. 40,1% of the metabolites formed remained structurally not identified, ca. 20% were identified as mono-OH-MXC, ca. 8% as bis-OH-MXC and ca. 3,5% as tris-OH-MXC. Metabolism studies with Nt, 1NtA1, 1NtA2 and 3NtA4 cultures showed that between 24 h and 72 h of incubation, the amounts of MXC decreased to one ninth to one sixteenth. Furthermore, a decrease in the amount of mono-OH-MXC to one third to one fivth was observed. Excepting the 3NtA4 cultures, amounts of tris-OH-MXC increased in all cultures. Whereas within 24 hours of incubation, tris-OH-MXC emerged in none of the cultures, it was found in all cultures after 72 hours ranging between 10,2% (1NtA1) and 19,9% (1NtA2). Comparison of the turnover of MXC in CYP2C19 cultures of carrot and tobacco revealed a higher metabolic activity of the transgenic carrot culture (+ 16%). Main metabolites were similiar to the non-transformed carrot culture. The higher portion of bis-OH-MXC (+ 6,5%) formed was probably due to the activity of the human enzym. In summary, all cell cultures tested were applicable tools to demonstrate metabolic pathways of MXC and in particular, the P450 isoform specifity. The separation of the R- and S-enantiomers was accomplished by chirale HPLC (CHIRALPAK®AD). The differences in the retention time were 6.8 min for mono-OH-MXC and 13.9 min for tris-OH-MXC. The optical rotation of S-mono-OH-MXC was [alpha] 26589 = +24,1 (c = 1,0, methanol); that of R-mono-OH-MXC [alpha] 26589 = -24,1 (c = 1,0, methanol). The enantioselectivity of the P450 isoforms was demonstrated by the samples of CYP3A4 and CYP2C19 cultures. Via HPLC (NUCLEODEX-gamma-PM), a distinctive separation of the enantiomers of mono-OH-MXC, derived from the 3DcA4 culture, was shown. This suggested the presence of both enantiomers. However, for the Dc and 2DcC19 culture only one signal was detected. According to the results of the 3DcA4 culture, the signal from the 2DcC19 culture was identified as S-mono-OH-MXC. Due to elution with higher retention time, the signal of the Dc culture was identified as R-mono-OH-MXC. With the YES assay, mono-OH-XC as well as bis-OH-MXC and tris-OH-MXC were found to be estrogenic in a concentration-responsive manner. The potency measured (relative to 17ß-estradiol, 10^-6-10^-8 g/L) was 10^-5-10^-4 g/L for mono-OH-MXC, 10^-4-10^-3 g/L for bis-OH-MXC and 10^-3-10^-2 g/L for tris-OH-MXC. These results were supported by the calculated EC50 values of 6,64 x 10^-5 g/L for mono-OH-MXC and 1,2 x 10^-5 g/L for bis-OH-MXC. In contrast to the racemate, the potency of mono-OH-MXC´s enantiomers was about tenfold higher. R-mono-OH-MXC showed a tenfold higher estrogenic activity than S-mono-OH-MXC.

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