Optimierte Immobilisierung von Redoxproteinen an funktionale Elektrodenoberflächen für die molekulare Bioelektronik

Schröper, Florian; Offenhäusser, Andreas

doi:0366-0885

Optimierte Immobilisierung von Redoxproteinen an funktionale Elektrodenoberflächen für die molekulare Bioelektronik = Optimized immobilization of redox proteins on functional electrode surfaces for molecular bioelectronics

Schröper, Florian (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Florian Schröper

ImpressumJülich : Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek 2009

UmfangIII, 224 S. : Ill., graph. Darst.

ReiheBerichte des Forschungszentrums Jülich ; 4300

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-04-20

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-28901
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/51579/files/Schroeper_Florian.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Cytochrom c (Genormte SW) ; Immobilisierung (Genormte SW) ; Bioelektronik (Genormte SW) ; Elektrochemie (Genormte SW) ; Elektronentransfer (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Affinitätstag (frei) ; His Tag (frei) ; Cys Tag (frei) ; Crossbar (frei) ; cytochrome c (frei) ; immobilization (frei) ; bioelectronics (frei) ; electrochemistry (frei) ; charge transfer (frei) ; affinity tag (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Innerhalb der vergangenen 10 Jahre hat die Bedeutung der proteinbasierten Elektrochemie an miniaturisierten Elektroden zunehmend an Bedeutung gewonnen, nicht nur um Ladungstransfereigenschaften von Redoxproteinen zu studieren, sondern auch um neuartige Biosensoren und bioelektronische Bauteile mit gesteigerter Sensitivität und Selektivität zu entwickeln. Die größten Herausforderungen innerhalb dieses Forschungsgebietes sind die gerichtete Kopplung zwischen elektronischen und biologischen Komponenten ohne dabei die Biofunktionalität zu verlieren, sowie die erfolgreiche Miniaturisierung der elektronischen Komponenten von 2D Makroelektroden über 2D Mikro- und 1D Nanoelektroden, bis zu 0D Nanokontakten für Einzelmolekülanwendungen. Proteine aus biologischen Elektronentransfersystemen, wie der Atmungskette oder dem Photosyntheseapparat, finden auf dem Gebiet der Protein Bioelektronik bevorzugt Verwendung. Typischerweise besitzen diese Proteine von außen zugängliche, redoxaktive Zentren und sind daher in der Lage effizient mit Elektroden zu kommunizieren. Diese Arbeit behandelt elektrochemische Untersuchungen des Ladungstransferverhaltens von Redoxproteinen im Hinblick auf Elektrodengröße und Immobilisierungsstrategie. Schwerpunkt der Untersuchungen lag auf dem Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c). Untersucht wurde das Ladungstransferverhalten dieses Proteins, immobilisiert auf makroskopischen, mikroskopischen und nanostrukturierten Elektroden. Neben der Verwendung konventioneller Immobilisierungsstrategien, wie kovalenter Immobilisierung oder Oberflächenanbindung mittels elektrostatischer Interaktionen, wurden neuartige Strategien zur gerichteten Proteinimmobilisierung entwickelt. Ziel dabei war es, eine optimierte Orientierung des Proteins auf der Elektrode und einen schnellen und reversiblen Elektronentransfer zwischen Elektrode und Protein unter Erhaltung der Funktionalität zu erreichen. Hierfür wurden neue Strategien zur gerichteten Immobilisierung von Pferdeherz Cyt c auf Goldelektroden mit Hilfe von definiert platzierten Bioaffinitätstags entwickelt. Durch Verwendung eines E. coli Expressionssystems für Cyt c und genetische Modifikationen wurden His und Cys Tags in die Aminosäuresequenz von Cyt c eingebracht. Nach erfolgreicher Expression und Aufreinigung wurde das Immobilisierungsverhalten der rekombinanten Proteine vergleichend, mittels Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie (SPR) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht. Die Funktionalität wurde durch einen photochemischen Enzymtest mittels UV/Vis Spektroskopie und elektrochemische Untersuchungen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass sich His genauso wie Cys getaggtes Cyt c auf Elektrodenoberflächen sowohl elektrostatisch, als auch über den spezifischen Affinitätstag immobilisieren lässt und dabei einen effizienten und schnellen Elektronentransfer ermöglicht. Zyklovoltammetrische Untersuchungen zeigten, dass bei Tag basierter Immobilisierung ein effizienter Elektronenaustausch zwischen Elektrode und Protein erfolgt und Cyt c gleichzeitig in der Lage ist mit im Elektrolyten gelösten Enzymen wie Cyt c Reduktase und Cyt c Oxidase zu interagieren. Darüber hinaus ermöglichte die simultane Verwendung von Affinitätstag und elektrostatischer Immobilisierung an zwei unterschiedlichen Stellen des Proteins, vollkommen neue Möglichkeiten für eine bifunktionale Immobilisierung zwischen zwei Elektroden. Die Bifunktionale Immobilisierung verschiedener Cyt c Mutanten wurde mittels SPR und AFM charakterisiert. Die Proteine wurden hierfür zunächst über den Affinitätstag an eine Goldoberfläche gebunden. In einem zweiten Immobilisierungsschritt ließen sich dann Gold Nanopartikel elektrostatisch an die Proteinschicht binden. In einem ersten Versuch konnte nachgewiesen werden, dass sich das rekombinante Cys getaggte Cyt c zwischen zwei mikroskopischen Crossbarelektroden immobilisieren lässt, wobei die Bindungen an die Bottomelektrode elektrostatisch und die Anbindung des Proteins an die Topelektrode über den Cys Tag erfolgte. Die Messung der Strom-Spannungs-Charakteristik ergab Tunnelströme, die sich auf den Ladungstransfer durch die immobilisierten Cyt c Moleküle zurückführen ließen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es somit gelungen verschiedene Typen an funktionalem, rekombinantem Cyt c herzustellen, die für eine bifunktionale Immobilisierung auf oder zwischen Elektrodenoberflächen eingesetzt werden können. Derartige bifunktional immobilisierte Proteine sind von besonderem Interesse im Bereich der molekularen Bioelektronik, im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger biosensorischer Bauteile, bei denen Proteine zwischen zwei sich kreuzenden Elektroden immobilisiert werden, oder sie im Einzelmolekülansatz einen Nanogap überbrücken. Die Entwicklung derartiger bioelektronischer Systeme ist Gegenstand der Forschung am Institut für Bio- und Nanosysteme 2 des Forschungszentrums Jülich.

Within the last decade, protein electrochemistry at miniaturized electrodes has gained in importance, not only for the study of the charge transfer properties of redox proteins, but also for developing novel biosensor and bioelectronic devices with enhanced sensitivity and selectivity. The major challenges within this field of research are the directed coupling between electronic and biological compounds without losing biofunctionality and a successful miniaturization of electronic compounds leading from 2D macroelectrodes over 2D micro- and 1D nanoelectrodes up to 0D nano contacts for single molecule approaches. Proteins from biological electron transfer systems like respiratory chain or photosynthesis, are preferably used in the field of protein bioelectronics. These proteins typically have redox active centers accessible to the outer surface and are thus able to efficiently communicate with electrodes. This thesis deals with electrochemical investigations of the charge transfer behavior of redox proteins with regards to electrode dimension and immobilization strategy. The main focus lies on the redox protein cytochrome c (cyt c). The charge transfer behavior of this protein was studied while immobilized on macroscopic, microscopic and nanostructured electrodes. Besides the use of previously reported immobilization strategies, e.g. covalent immobilization or attachment via electrostatic interaction, novel strategies for a directed protein immobilization were developed. The aim was to achieve an optimized orientation of the protein on the electrode allowing a fast and reversible electron transfer between electrode and protein as well as the conservation of functionality, such that the active site remains accessible for enzyme binding and interaction. For this purpose, new strategies to direct immobilization of horse heart cyt c on gold electrode surfaces using bioaffinity tags at specified positions within the protein were developed. By using an expression system for cyt c in E. coli and genetic modifications, His and/or Cys tags were incorporated into the amino acid sequence at strategically defined positions. After successful expression and purification, comparative immobilization studies of different recombinant proteins and native cyt c were performed by means of Surface Plasmon Resonance Spectroscopy (SPR) and Atomic Force Microscopy (AFM). Functionality was proven by a photochemical enzyme test using UV/Vis spectroscopy and electrochemical studies. Thereby it was possible to demonstrate that both His and, moreso, Cys tagged cyt c can be immobilized on electrode surfaces either by electrostatic interaction as well as via its affinity tag, while still providing sufficient and fast electron transfer. Cyclovoltammetric studies demonstrated that tag-based immobilization enabled the proteins to exchange electrons with the supporting electrode and at the same time interact with the enzymes cytochrome c reductase as well as cytochrome c oxidase which were dissolved in the electrolyte. Moreover the combination of two different immobilization strategies, simultaneously using affinity tag and electrostatic immobilization at two different sites, enabled completely new possibilities for bifunctional immobilization of proteins. Bifunctional immobilization of different cyt c mutants was characterized by SPR and AFM. The proteins were first immobilized on a gold surface via an affinity tag, and in a second immobilization step, gold nanoparticles were immobilized on top of this protein layer by electrostatic interaction. In a first approach the recombinant Cys tagged protein was immobilized between two microscopic crossbar electrodes by electrostatic immobilization and via the Cys tag at the same time. Measuring the current-voltage characteristics revealed tunneling currents attributed to the charge transfer through the cyt c molecules. Thus it succeeded to develop different types of functional recombinant cyt c that can be used for bifunctional immobilization on or between electrode surfaces. Such bifunctional immobilized proteins are of special interest in the field of molecular bioelectronics, in particular for the development of novel biosensing devices where proteins can be immobilized between two crossing electrodes or bridging a nano gap within single molecule approaches. Further research at the Institute of Bio- and Nanosystems 2 in Jülich is addressed to the development of such systems.

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