Optimisation of trierucin content in oilseed rape

Batra, Neelu; Frentzen, Margarete

doi:1205

Optimisation of trierucin content in oilseed rape

Batra, Neelu (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Neelu Batra

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

Umfang97 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Frentzen, Margarete (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2005-07-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-12053
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51992/files/Batra_Neelu.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Landwirtschaft, Veterinärmedizin (frei) ; Trierucin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 630

Kurzfassung
Rapslinien mit hohem Erucasäure-Gehalt (HEAR) sind für industrielle Anwendungen interessant, weil Erucasäure (22:1) einen wertvollen nachwachsenden Rohstoff mit einer Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten darstellt, wenn sie in ausreichenden Mengen und in ausreichend reiner Form zur Verfügung gestellt wird. In konventionellem HEAR-Öl ist der 22:1-Gehalt jedoch auf 67% limitiert, da 22:1 aus der sn-2-Position des Glycerin-Gerüstes ausgeschlossen ist. Um diese theoretische Obergrenze in HEAR-Ölen zu überwinden und somit die oleochemischen Eigenschaften zu verbessern, wurden in der Vergangenheit kombinierte züchterische und gentechnische Versuche unternommen. Die Coexpression eines 22:1-CoA-spezifischen Lysophosphatidsäure-Acyltransferase(LPAAT)-Gens mit einem ß-Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS)-Gen in reifenden Samen von HEAR-Pflanzen führte zwar zur Einschleusung von 22:1 in die sn-2-Position, aber nur zu einer geringen Steigerung des 22:1-Gesamtgehalts. Die in dieser Arbeit durchgeführten enzymatischen Analysen mikrosomaler Fraktionen reifender Samen zeigten, dass das eingeführte KCS-Gen in reifenden Samen der transgenen HEAR-Pflanzen funktional exprimiert wurde und einen dreifachen Anstieg sowohl in der KCS- als auch in der Gesamt-Elongaseaktivität bewirkte, welche die Malonyl-CoA-abhängige Elongation von Oleoyl(18:1)-CoA über Eicosenoyl(20:1)-CoA zu 22:1-CoA katalysiert. Diese Ergebnisse lieferten weitere Beweise dafür, dass die KCS den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Elongasekomplexes katalysiert. Die Analyse der Acyl-CoA- und Fettsäurezusammensetzung in den reifenden Samen der transgenen HEAR-Pflanzen zeigte jedoch, dass sich während der Phase der maximalen Ölakkumulation die erhöhte Elongaseaktivität nicht länger in einem erhöhten 22:1-Gehalt widerspiegelte. Dies deutete daraufhin, dass die Elongase-Aktivität und damit die Syntheserate von 22:1-CoA in reifenden Rapssamen durch andere Faktoren, wie z.B. den verfügbaren cytosolischen Substrat-Pool, limitiert wird. Um diese Hypothese zu überprüfen und den cytosolischen Acetyl-CoA- und Malonyl-CoA-Pool in reifenden Rapssamen zu erhöhen, wurden mit einem ATP:Citrat-Lyase- bzw. einem Acetyl-CoA-Carboxylase-Gen chimäre Konstrukte für die Rapstransformation entwickelt. Wie die Analyse der Samenöle transgener Rapspflanzen zeigte, führte die Überexpression des chimären Acetyl-CoA-Carboxylase-Gens zu einem leichten Anstieg des 22:1-Gehalts. Diese Daten deuten darauf hin, dass es möglich sein sollte, eine weitere Erhöhung des 22:1-Gehaltes zu erreichen, wenn es gelingt, die Acetyl-CoA-Carboxylase einer mit ATP:Citrat-Lyase, KCS und einer 22:1-CoA spezifischen LPAAT in reifenden Samen von HEAR-Rapspflanzen zu exprimieren. Auch das „sink-source“ Verhältnis im Samen ist für eine Erhöhung des Gehalts an ungewöhnlichen Fettsäuren von großer Bedeutung. Der Ölgehalt im Samen wird maßgeblich durch die Aktivität der Diacylglycerin-Acyltransferase (DAGAT) bestimmt, die im letzten Schritt der Triacylglycerin-Synthese die Acylierungsreaktion an der sn-3-Position von Diacylglycerin katalysiert. Um den Sink zu verstärken wurde daher ein chimäres Gen für eine DAGAT, die 22:1 effektiv in das Reservelipid einschleust, in reifenden Samen überexprimiert. Dazu wurden insgesamt sechs DAGAT cDNAs aus Pflanzen, die in ihren Samenölen fast ausschließlich sehr langkettige Acylreste in der sn-3-Position enthalten, und zwar drei aus Brassica napus, eine aus Tropaeolum majus und zwei aus Lesquerella lindheimeri kloniert und funktional charakterisiert. Die von diesen cDNAs kodierten DAGATs besitzen ein ähnliches Molekulargewicht und abgesehen von ihren N-terminalen hydrophilen Domänen, sehr ähnliche Sequenzen. Die Analyse der enzymatischen Eigenschaften dieser in Hefe überexprimierten isofunktionalen Enzyme zeigte deutliche Unterschiede im Hinblick auf ihre Acyl-CoA-Spezifitäten und Selektivitäten. Die DAGAT von T. majus wies die geringste Präferenz für sehr langkettige Acylreste auf, während die DAGATs von L. lindheimeri die höchste Präferenz besaßen. Trotz der hohen Sequenzidentität zwischen den beiden DAGATs aus L. lindheimeri zeigte LlDAGAT1 eine deutlich ausgeprägtere Spezifität für 20:1-CoA und 22:1-CoA im Vergleich zu 18:1-CoA als LlDAGAT2. Um die molekularen Grundlagen für die unterschiedlichen Acyl-CoA-Spezifitäten der beiden DAGATs von L. lindheimeri aufzuklären, wurde mit dem Austausch von DAGAT-Domänen und gezielten Mutagenese-Experimenten begonnen. Der Vergleich chimärer und mutierter DAGAT-Sequenzen mit den Wildtyp-Proteinen lieferte Hinweise dafür, dass die Acyl-CoA-Bindedomäne im N-terminalen Bereich der Enzyme und Isoleucin 315 in der Fettsäure-Bindedomäne für die Acyl-CoA-Spezifität essentiell sind. Bei diesen Versuchen konnte darüber hinaus eine chimäre Sequenz entwickelt werden, die für eine DAGAT mit einer verbesserten 22:1-CoA-Spezifität kodiert. Diese chimäre Sequenz sollte somit in Kombination mit einem KCS- und einem 22:1-CoA-spezifischen LPAAT-Gen besser geeignet sein, den 22:1-Gehalt im Öl transgener HEAR-Pflanzen zu steigern, als die in der vorliegenden Arbeit verwendete LlDAGAT2-Sequenz.

High erucic acid rapeseed (HEAR) cultivars have regained interest for industrial purposes because erucic acid (22:1) is a valuable feedstock with a wide range of applications especially if it is available in sufficient quantities and in sufficiently pure form. In HEAR oil, however, the 22:1 content is limited to 67% because 22:1 is excluded from the sn-2 position of the glycerol backbone. To overcome this theoretical limit in HEAR oil and, thus, to improve its oleochemical properties combined efforts in plant breeding and genetic engineering have been undertaken. Co-expression of an 22:1-CoA specific lysophosphatidate acyltransferase gene with a ß-ketoacyl-CoA synthase (KCS) gene in developing seeds of HEAR plants resulted in the channeling of 22:1 into each position of the glycerol backbone but hardly improved the total 22:1 content. The enzymic investigations with microsomal fractions of developing seeds conducted in the present study clearly showed that the introduced KCS gene was functionally expressed in the developing seeds of the transgenic HEAR plants and affected a threefold increase in KCS as well as elongase activity catalyzing the malonyl-CoA dependent elongation of oleoyl(18:1)-CoA via eicosenoyl(20:1)-CoA to 22:1-CoA. These data provide further evidence that KCS rather than the further three enzymes of the elongase systems catalyzes the rate limiting step. Analysis of the acyl-CoA and fatty acid composition in the course of seed development, however, revealed that during the phase of maximal oil accumulation the improved elongase activity of the developing seeds from the transgenic HEAR plants was no longer reflected in their 22:1 levels. These data suggest that the elongase activity and, thus, the formation rate of 22:1-CoA is limited by other factors such as the substrate pools available to the elongase complex. In order to improve the cytosolic acetyl-CoA and malonyl-CoA pool, chimeric gene constructs encoding ATP:citrate lyase and acetyl-CoA carboxylase were developed and introduced into HEAR lines. An overall increase in the 22:1 content of seed oil from transgenic plants was achieved by the over-expression of the chimeric acetyl-CoA carboxylase gene. According to these data it is likely that a further increase in the 22:1 content can be achieved by the co-expression of the acetyl-CoA carboxylase gene with the ATP:citrate lyase, KCS and 22:1-CoA specific lysophosphatidate acyltransferase gene. In addition, the sink-source relationship is important for the increase of unusual fatty acids in seed oils. Oil yield is decisively determined by the activities of the diacylglycerol acyltransferase (DAGAT) which catalyzes the acylation reaction at the sn-3 position of diacylglycerol in the final step of TAG synthesis. Hence, to improve the source strength by over-expressing a DAGAT that effectively channels 22:1 into TAG, DAGAT cDNAs were cloned and functionally characterized from Brassica napus, Tropaeolum majus and Lesquerella lindheimeri, the seed oils of which almost exclusively carry very long chain acyl groups at the sn-3 position. Six cDNAs, namely three of B. napus, two of L. lindheimeri and one of T. majus, were analyzed. The DAGATs encoded by these cDNAs possess very similar molecular masses, and apart from their N-terminal hydrophilic regions, their sequences are very similar to each other. The analysis of the properties of the DAGATs over-expressed in yeast revealed differences between the isofunctional enzymes especially with regard to their acyl-CoA specificities and selectivities. The DAGAT from T. majus displayed the lowest and those from L. lindheimeri the highest preference for very long chain acyl groups. Moreover, in spite of the high sequence identity between the two DAGATs of L. lindheimeri, DAGAT1 showed a more pronounced specificity for 20:1-CoA and 22:1-CoA in comparison to 18:1-CoA than DAGAT2. In order to elucidate the molecular basis of the different acyl-CoA specificities of the two DAGATs from L. lindheimeri, initial domain swapping and site directed mutagenesis experiments were conducted. The analysis of the acyl-CoA specificities of the chimeric and mutated DAGATs compared to DAGAT1 and DAGAT2 provided evidence that the acyl-CoA binding domain within the N-terminal region and isoleucine 315 in the fatty acid binding domain, which is substituted by a threonine in DAGAT1, can essentially determine acyl-CoA specificity. Moreover, these experiments resulted in the development of a DAGAT with an improved 22:1-CoA specificity. Consequently, the respective sequence appears to be better suited for improving the 22:1 content of HEAR oil than the DAGAT2 sequence used for rapeseed transformation in the present study in combination with a B. napus KCS and a 22:1-CoA specific lysophosphatidate acyltransferase gene.

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