Generation and characterisation of plant produced recombinant antibodies specific to LHRH for treatment of sex hormone dependent diseases

Nath, Richa; Fischer, Rainer

doi:743

Generation and characterisation of plant produced recombinant antibodies specific to LHRH for treatment of sex hormone dependent diseases

Nath, Richa (Author)

2003 & 2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Richa Nath

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2003

Umfang159 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2003

Prüfungsjahr: 2003. - Publikationsjahr: 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2003-07-29

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-7433
DOI: 10.18154/RWTH-CONV-121071
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59270/files/59270.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pflanzen (Botanik) (frei) ; Recombinant antibodies (frei) ; transgenic plants (frei) ; molecular farming (frei) ; molecular biotechnology (frei) ; scFv (frei) ; chimeric antibody (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 580

Kurzfassung
Bei dem Luteinisierende Hormon-Releasing Hormon (LHRH, syn. GnRH) handelt es sich um ein hypothalamisches Dekapeptid das eine Schlüsselposition in der endokrinen Kontrolle der Reproduktion einnimmt. Durch die Bindung an spezifische Rezeptoren reguliert es über eine Signalkaskade die Synthese und Freisetzung des Luteinisierenden Hormons (LH) und des Follikel-Stimulierenden Hormons (FSH) in den gonatropen Zellen. Die Manipulation der neuroendokrinen Kaskade durch LHRH-Agonisten welche die Wirkung des natürlichen Dekapeptids potenzieren oder LHRH-Antagonisten die das körpereigene Hormon kompetitiv von seinem Rezeptor verdrängen führt zu einem Zustand, den man als reversible medikamentöse Kastration bezeichnet, und der bei der Behandlung von Sexualhormon-abhängigen Krankheiten hilfreich ist. Die hormonalen Signalkaskade kann jedoch ebenfalls durch neutralisierende anti-LHRH Antikörper blockiert werden. Während die Behandlung mit LHRH Analogen sehr kostspielig ist da sie eine mehrmalige Verabreichung des Therapeutikums verlangt, ist die aktive Immunisierung gegen LHRH nur limitiert durch die Varianz im Immunrespons der Patienten sowie durch einen verzögerten therapeutischen Effekt bedingt durch den Aufbau des Antikörper-Titers. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Generierung rekombinanter anti-LHRH Antikörper, deren pflanzlicher Expression und Einsatz in der passiven Immunisierung zur Behandlung von Sexualhormon-abhängigen Krankheitsbildern. Hierzu wurden die variablen Domänen eines murinen monoklonalen Antikörpers (mAb) zur Konstruktion eines monovalenten (scFv) und bivalenten (Dia-scFv) Antikörper Fragmentes verwendet. Zur Generierung eines chimären Maus/Humanen Vollängen Antikörpers wurde die Antigenbindende Domäne mit den konstanten Domänen einer humanen IgG1 schweren und Kappa leichten Kette verknüpft. Die kodierende Gensequenz der generierten Antikörper Fragmente wurde anschließend in einen pflanzliche Expressionsvektoren überführt, transient in Tabakblättern exprimiert und über eine Affinitätschromatographie aufgereinigt. Während der chimäre Antikörper moderat in Tabak akkumulierte waren die Expressionsraten des scFv und des Dia-scFv sehr niedrig. Alle drei Antikörper Fragmente erwiesen sich jedoch in den ELISA und SDS-PAGE Analysen als stabil und funktionell. Die Dissoziationskonstante (KD) des pflanzlich exprimierten chimäre Volllängen-Antikörpers wurde durch die Methode der Plasmaresonanzanalysen bestimmt und war identisch zu der des parentalen murinen monoklonalen Antikörpers. Die Inkubation in humanem Serum in vitro bei einer physiologischer Temperatur von 37°C zeigte nach 32 Tagen für den chimären rAb eine 70% und für den murinen mAb eine 60% Antikörperaktivität. Beide Volllängen-Antikörper waren effektiv im biologischen System, d.h. die Antikörper verursachten einen Stillstand im östrogenem Zyklus bei Mäusen. Die Dauer der Disruption korrelierte mit der Dosis der verabreichten Antikörper. Um weitere Informationen über die Antigenbindende Domäne, den Paratop, des murinen mAb zu erhalten wurde der Antikörper gegen eine 12-mer Peptidpräsentierende Phagenbibliothek „gepannt“. Paratopspezifische Peptide wurden herausselektioniert, es zeigten sich jedoch keine Homologien zu einem Abschnitt der LHRH Aminosäuresequenz. Es muss also angenommen werden das ein sogenanntes Mimotop selektioniert wurde. Bindungsanalysen unter Verwendung des murinen mAbs und einiger LHRH Varianten zeigten außerdem, dass der Antikörper zwei andere humane Isoformen des LHRH erkennt.

Leutinising hormone releasing hormone (LHRH) is a hypothalamic neurohormone that plays a pivotal role in the endocrine control of reproduction. Acting through its high affinity receptors on pituitary gonadotrophs, it regulates the secretion of gonadotropins. Manipulation of the neuroendocrine cascade by LHRH intervention leads to the down regulation of sex steroid levels resulting in a state of pharmacological castration, a physiological state useful for treatment of sex hormone dependent diseases. The neuroendocrine axis can be obliterated by synthetic LHRH analogues or by neutralising anti-LHRH antibodies. While the LHRH analogues require frequent dose administration and are expensive, active vaccination against LHRH is limited by the variation in the immune response from patient to patient and the lag period in the build-up of effective antibody titres. The aim of this project was the generation of recombinant anti-LHRH antibodies and their expression in plants for use in passive immunisation for treatment of sex hormone dependent disorders. This thesis reports the construction of a single chain variable fragment, a diabody and a mouse/human full-length chimeric antibody by recombinant DNA technology. The variable domains that constituted these antibody molecules were derived from a high affinity anti-LHRH mouse mAb. The antibodies were transiently expressed in tobacco leaves by vacuum-assisted agro-infiltration and purified by affinity chromatography. While the chimeric antibody was expressed at moderately high levels in tobacco leaves the expression levels of the scFv and diabody fragments was found to be low. All three affinity purified antibody molecules were functional, pure and intact as determined by ELISA and SDS-PAGE analysis. The equilibrium constants of the plant expressed chimeric rAb and the parental murine mAb, as measured by SPR using BIAcore, were found to be indistinguishable. Incubation of chimeric rAb and the mouse mAb in human serum in vitro revealed high stability of both the mouse mAb and the chimeric antibody at the physiological temperature. Antibody activity after 32 days at 37°C in human serum was determined to be 70% for chimeric rAb and 60% for mouse mAb. Both the anti-LHRH mAb and the plant derived chimeric antibody were shown to be bio-effective. The antibodies caused an arrest in the estrus cycle of regularly cycling rodents. The duration of the estrus cycle disruption was found to be related to the dose of the antibody administered. A set of related peptide motifs were also isolated from a phage displayed random 12-mer-peptide library that unambiguously bound to the LHRH specific chimeric mAb. The isolated peptides are mimotopes, as they do not show any similarity with LHRH at the primary structural level. Furthermore, binding analysis of a few LHRH variants with the murine mAb revealed that the antibody also recognizes two other isoforms of LHRH reported to be found in humans.

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