Antikörper vermittelte Fusarien-Resistenz in transgenen Pflanzen

Peschen, Dieter; Fischer, Rainer

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-3530

Antikörper vermittelte Fusarien-Resistenz in transgenen Pflanzen

Peschen, Dieter (Author)

2002

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Dieter Peschen

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2002

Umfang162 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2002

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2002-06-04

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-3530
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61344/files/Peschen_Dieter.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der Landwirtschaft und im Zierpflanzenbau verursachen pathogene Pilze große Schäden. Pilze befallen sowohl die Pflanze als auch den Samen und kontaminieren diese durch Mykotoxine und andere Stoffwechselprodukte. Resistente Wildarten stehen der klassischen Züchtung oftmals nicht zur Verfügung, so dass die einzige Bekämfung darin besteht, Fungizide einzusetzen, die zusätzliche Gefahren für die Umwelt und den Verbraucher sowie Kosten beinhalten. Die Verwendung von rekombinanten pilzinaktivierenden Antikörpern in transgenen Pflanzen ist eine vielversprechende Alternative, um diesen Problemen in einer verbraucherfreundlichen Art und Weise entgegenzuwirken. Das Ziel dieser Dissertation war es deshalb, scFv-Antikörper gegen Oberflächenstrukturen von Fusarien zu generieren, diese mit antifungalen Peptiden und Proteinen (AFP) zu fusionieren, in der Pflanze zu exprimieren und dadurch eine Resistenz gegen den Schadpilz zu vermitteln. Zur Herstellung pilzresistenter scFv Antikörper wurden Hühner mit diversen pilzlichen Antigenpräparationen immunisiert. Aus den Milzzellen wurden die Gesamt-RNS und mRNS isoliert, cDNS synthetisiert, die VH- und VL-Domänen amplifiziert und über die eingefügten Restriktionsschnittstellen in einem Phagemid-Vektor zu scFv Bibliotheken zusammengefügt. Die Diversität der Bibliotheken wurde überprüft und die vielversprechensten Bibliotheken vereinigt und gegen die verschiedenen pilzlichen Antigene im „Phage Display“ gepannt. Nach der dritten Runde des „Phage Displays“ wurden die löslichen scFvs auf ihre Antigenbindungsspezifität überprüft und die stärksten Antigen-bindenden scFvs exprimiert und gereinigt. Die Charakterisierung der gereinigten scFvs CWPD2, FPCWPA5 und SGB3 erfolgte mittels ELISA, Immunoblot und Immunofluoreszenz. Die scFvs wurden mit unterschiedlichen AFP fusioniert und sowohl die scFvs als auch die AFP-scFv Fusionen in verschiedene Vektor- und Expressionssysteme umkloniert und deren inhibitorischer Effekt in vitro demonstriert. Abschließend wurden Resistenztests mit stabil transformierten Arabidopsis-Pflanzen der F2-Generation durchgeführt. Bei diesen Versuchen konnte gezeigt werden, dass die AFP-scFv Konstrukte AG-scFv CWPD2, RS-scFv CWPD2, Lacto-scFv CWPD2 und Chi-scFv CWPD2 zu einer Antikörper-vermittelten Resistenz von A. thaliana cv. Columbia gegen F. oxysporum f.sp. matthiolae führten.

Pathogenic fungi lead to large yield losses in agriculture and in ornamental plant production. They attack plants as well as seeds and contaminate them with mycotoxins and other metabolites. Resistant wild type species are often not available, so the only possibility to combat fungal pathogen is the use of fungicides which include risks for environment and the consumers as well as costs. The use of recombinant antibodies in transgenic plant to generate fungal pathogen resistant plants is a promising way to solve these problems in a consumer-friendly way. The goal of this work was to generate scFv antibody fragments against surface structures of Fusarium. These scFvs were be fused to antifungal peptides and proteins (AFP) and expressed in plants and should mediate resistance against the pathogenic fungi in planta. To generate scFv antibodies chicken were immunized with different fungal antigen-preparations. The total-RNA and the mRNA was isolated from spleen cells, the cDNS was synthesized, the VH- and VL-domains were amplified and assembled into a phagemid vector via restriction sites to generate scFv libraries. The diversity of the libraries was determined and the most promising libraries were combined and panned via Phage Display against fungal antigens. Soluble scFvs were tested for antigen binding activity after the third round of panning and the best binding scFvs were expressed in bacteria. The purified scFvs CWPD2, FPCWPA5 and SGB3 were characterised by ELISA, immunoblot and immunofluorescence. The scFvs were fused to different AFP and the scFvs as well as the AFP-scFv-fusions were cloned into different vector- and expression systems and their inhibitory effect was demonstrated in vitro. Resistent tests on stable transformed F2-plants of Arabidopsis demonstrated that the AFP-scFv constructs AG-scFv CWPD2, RS-scFv CWPD2, Lacto-scFv CWPD2 and Chi-scFv CWPD2 mediated antibody-resistance against F. oxysporum f.sp. matthiolae in A. thaliana cv. Columbia plants.

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