Physiologische und genetische Charakterisierung der Gamma-Aminobutyrat-(GABA)-Aminotransferase in Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39

Prell, Jürgen; Priefer, Ursula B.

doi:24760

Physiologische und genetische Charakterisierung der Gamma-Aminobutyrat-(GABA)-Aminotransferase in Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39

Prell, Jürgen (Author)

2003

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jürgen Prell

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2003

Umfang127 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2003

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Priefer, Ursula B. (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2003-01-23

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-5260
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61380/files/Prell_Juergen.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die gabRTD Region aus Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 identifiziert und systematisch analysiert. Zugrunde lag die Tn5-B20 Mutante PH10, die in einem Screening auf unterschied-lichen pH Werten ansteigende Induktion des lacZ-Reporters auf niedrigen pH Werten zeigte. Nach Klonierung des Transposons konnten ca. 2,5 kb flankierende DNA sequenziert werden. Die Sequenz beinhaltete den vollständigen gabT Leserahmen, der für eine GABA Aminotransferase kodiert. Im Anschluß an gabT fand sich der 5'-kodierende Bereich von gabD, einer vermutlichen Succinatsemialdehyd Dehydrogenase (SSDH). Beide Enzyme sind Teil des sogenannten GABA shunts, der für die Metabolisierung von GABA verantwortlich ist und zusammen mit Glutamat Dekarboxylase eine theoretische Umgehung des 2-Oxoglutarat Dehydrogenase Komplexes im Zitrat-zyklus darstellt. Upstream von gabT liegt ein Leserahmen gabR in umgekehrter Orientierung, der für einen Regulator der MerR Familie kodiert. Im Verlauf der Arbeit wurde zunächst der Phänotyp der PH10 Mutante analysiert. Da sich auf Minimalmedien mit GABA als einziger Kohlen- und Stickstoffquelle kein Wachstumsunterschied zum Wildtyp zeigte, wurden Enzymassays von 2-Oxoglutarat abhängiger GABA Aminotransferase aus Rohextrakten der Mutante und des Wildtyps verglichen. Es zeigten sich moderate Aktivitäten im Wildtyp, jedoch keine meßbare Aktivität in der Mutante. Allerdings wurden in PH10 so wie im Wildtyp hohe Pyruvat abhängige GABA Aminotransferase Aktivitäten festgestellt, die das Wachstum der Mutante auf GABA als alleiniger Nährstoffquelle erklärt. Zur Analyse der Expression von gabT wurde zunächst der Promotor-Probe Vektor pJP2 konstruiert. Dieser Vektor enthält ein promotorloses uidA Gen, das zur Expression von GUS als Reporterenzym dient. Des Weiteren ist der Vektor durch die par Gene von RK2 auch unter symbiontischen Bedingungen stabil. Stabile Plasmide sind in der genetischen Rhizobien-Forschung interessante Werkzeuge. Deshalb stellt pJP2 ein wichtiges Produkt dieser Arbeit dar. Nach Klonierung der gabT Promotorregion in pJP2 wurde die Expression im Wildtyphintergrund VF39 zunächst auf unterschiedlichen pH Werten getestet. Dabei konnten die lacZ Induktionsdaten von PH10 bestätigt werden. Als nächstes wurden verschiedene Kohlen- und Stickstoffquellen, die am GABA Metabolismus innerhalb des GABA shunts beteiligt sein könnten, auf ihre Induktion von gabT hin untersucht. Es zeigte sich, daß gabT in der Tat von GABA induziert wird. Während der Symbiose mit Pisum sativum wurde gabT während der Bakteroiden-differenzierung induziert und in der symbiontischen Zone stark expremiert. Die gabT Mutante PH10 bildete allerdings normal fixierende Knöllchen. Der bereits erwähnte Leserahmen gabR upstream von gabT wurde auf Grund seiner Homologie zu regulatorischen Genen auf eine eventuelle Rolle als Regulator für gabT hin überprüft. In einer gabR Mutante nahm die gabT Expression stark zu, was zu dem Schluß führte, daß gabR als Repressor oder Repressor/Aktivator von gabT fungiert. Über die Rolle von gabD konnten nur wenige Aussagen gemacht werden. Es konnten weder reduzierte NAD+ abhängige SSDH Enzymaktivitäten in gabT Mutanten nachgewiesen werden, noch gingen von der intergenischen Region zwischen gabT und gabD eigene Promotoraktivitäten aus. Des Weiteren konnten keine zusätzlichen GABA metabolisierenden Gene über klassische Transposon Mutagenesen identifiziert werden.

In the frame of this work the gabRTD region of Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 was identified and systematically analysed. Starting from a Tn5-B20 mutant PH10 which was found to show increasing induction of the lacZ-reporter on low pH media, the transposon was cloned and 2.5 kb of flanking DNA were sequenced. The sequence contained the full gabT open reading frame, coding for a GABA aminotransferase. Downstream of gabT the 5'-coding region of a succinate semialdehyde dehydrogenase (SSDH) was found and designated gabD. Both enzymes are part of the so called GABA shunt, which is the major pathway for GABA metabolism and in combination with glutamate decarboxylase a theoretical bypass of the 2-oxoglutarat dehydrogenase complex of the TCA cycle. Upstream of gabT a third ORF oriented in the opposite direction and carefully designated gabR shows homology to a MerR type regulator. Starting the analysis of the PH10 mutant phenotype, it was shown, that growth on GABA as a sole carbon and nitrogen source was not different from wild-type. Enzyme assays from protein crude extracts showed moderate 2-oxoglutarat dependent GABA aminotransferase activities in wild-type and the absence of activity in the mutant. In contrast pyruvate dependent GABA aminotransferase activities where very high in both strains, which easily explained the mutant growth phenotype on GABA. For the further analysis of gabT expression, a promoter-probe vector pJP2 was constructed. This plasmid contains a promoterless uidA gen, which is able to express GUS as a reporterenzyme. Further features of the vector are the par genes from RK2 maintaining stability during symbiosis. Stable plasmids are interesting tools in Rhizobium-research. Therefore pJP2 is an important result of this work. After cloning the gabT promoter-region into pJP2 and introducing the plasmid into wild-type VF39, pH dependent expression was measured. The results were compa-rable to the lacZ induction of PH10. Then the involvement of gabT in the GABA metabolism was investigated during growth on related carbon and nitrogen sources. GABA was shown to induce the fusion. During symbiosis with Pisum sativum, gabT was induced during bacteroid differentiation and strongly expressed in the symbiotic zone. However, the PH10 mutant formed normal nitrogen fixing nodules. The above mentioned gabR open reading frame was analysed for being involved in gabT regulation, because of its homology to regulatory genes. In a gabR mutant, gabT expression was strongly increased, what led to the conclusion, that gabR must act as a repressor or repressor/activator of gabT. The role of gabD could be only poorly described. In gabT mutants NAD+ dependent, SSDH activities were unaffected and there was no measurable promotor activity expressed by the gabT and gabD intergenic region. Furthermore it was not possible to identify other GABA metabolising enzymes with classical transposon mutagenesis.

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