Structural study of human antibody fragments with specificity for Mucin-1 antigen

Gaur, Rajneesh Kumar; Fischer, Rainer

doi:HT014155840

Structural study of human antibody fragments with specificity for Mucin-1 antigen

Gaur, Rajneesh Kumar

2004

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Rajneesh Kumar Gaur

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2004

UmfangIV, 165 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-09-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-9325
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62026/files/Gaur_Rajneesh.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Antibody (frei) ; Mucin-1 (frei) ; Limited Proteolysis (frei) ; Crystallization (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
MUC1 ist bei vielen Adenokarzinomen überexpremiert, das es zu einem potentiellen Ziel für Immunotherapie macht. Eine große Anzahl von MUC1-spezifischer, monoclonaler Antikörper sind hergestellt worden aber die Stabilität, Löslichkeit und die Größe von Antikörper bestimmt ihre Wirksamkeit in der Krebstherapie. Kleinere Antikörperfragmente sind Vorteilhaft gegenüber vollen Antikörpern, die kleine Antigene wirksamer binden und in stabile Tumoren eindringen können. Als ein erster Schritt nach dem Entwurf von einem klinisch wünschenswerten Antikörperfragment ist die Kristallisation eines menschlichen VH Fragment erreicht worden. Das Fragment wurde vom humanen Antikörper scFvM12 Fragment abgeleitet, welches tumorsspezifisches glykosiliertes MUC1 erkennt. Die menschliche M12-VH Domäne ist durch limitierte in-vitro Proteolyse des scFvM12 Antikörperfragment kristallisiert worden. Kristalle von M12-VH Domäne sind in ungefähr 12 Monaten bis zu einer Größe von 180x60x60æm in 100 mM MES, pH 6,5, 5 mM Zinksulfat, 25% (v/v) Polyethylenglycol 550 Monomethylether in Gegenwart niedriger Konzentrationen von Subtilisin Carlsberg gewachsen. Durch die Zugabe der Protease wurde ein vollständiger Abbau der M12-VL Domäne, des Linkers und des Reinigungstags erreicht. Der Kristall gehört zu der Rangruppe C2 mit a = 71,34Å, b = 37,97Å, c = 37,19Å und ( = ( = 90ø, ( = 109,674ø. Der Lösungsmittelgehalt das Kristalls wurde mit 35,94% bestimmt. Die Struktur wurde bis zu einer maximalen Auflösung von 1.5Å mit einem Rcryst Faktor von 15,8% und einem Rfree von 19,7% gelöst und zeigt eine gute Stereochemie. Der Vergleich der dihedralen Winkel der ersten und zweiten CDR von M12-VH Domäne zeigen signifikante Unterschiede zu den bekannten durchschnittlichen Werten und daher kann spekuliert werden, daß die M12-VH Domäne eine neue kanonischeUnterklasse bildet oder eine Verbindung zwischen Subklasseen von kannonischen Hauptkettenkonformationen bildet. Die in der Natur beobachtete Existenz der Mutationen Glu-H6, Arg-H66 und Ser-H52 verleiht M12-VH Domäne die innere Stabilität unter reduzierenden Bedingungen, daher kann diese Antikörperdomäne als Vorbild fur andere Spezifitäten benutzt werden. Dieses Ergebnis ist nützlich bei dem strukturbasierten Design von Antikörperfragmenten für biotechnologische und pharmazeutische Anwendungen besonders mit MUC1 assozierten Tumoren. Isolierte VH Domänen aggregieren aufgrund der hydrophoben Oberfläche, die in die Kontaktfläche von VH/VL involviert ist. Die Kamelisierung von den Positionen H44, H45 und H47 kann die Hydrophilizität in der VH Domäne verstärken. Native und kamelisierte M12-VH Domänen, die im cytoplasmatischen Vektor expremiert werden, sind nützlich beim Abschätzen der immunogenen Wirkung kamelisierter menschlicher VH Domänen.

MUC1 is overexpressed in many adenocarcinomas, which makes it a potential target for immunotherapy. A large number of MUC1-specific, monoclonal antibodies have been produced but the stability, solubility and the size of the antibody determines their effectiveness in cancer therapy. Smaller antibody fragments are advantageous over full-size antibodies, since small antigen binding molecules can efficiently penetrate solid tumors. As a first step towards the design of a clinically desirable antibody fragment, the crystallization of a human VH fragment has been achieved. The fragment was derived from the human single chain antibody scFvM12, which recognizes the cancer-specific hypoglycosylated MUC1. The human M12-VH domain has been crystallized through limited in-vitro proteolysis of scFvM12 antibody fragment. Crystals of M12-VH domain grew in approximately 12 months up to a size of 180x60x60µm in 100mM MES, pH 6.5, 5mM zinc sulphate, 25% v/v polyethylene glycol 550 monomethylether in the presence of low concentration of subtilisin Carlsberg. The protease addition results in complete degradation of M12-VL domain, linker and purification tags. The crystal belongs to space group C2 with unit cell dimension a = 71.34Å, b = 37.97Å, c = 37.19Å and alpha = gamma = 90°, beta = 109.674°. The solvent content of the crystal was calculated as 35.94%. The structure was solved up to 1.5Å resolution with an Rcryst factor of 15.8%, an Rfree of 19.7% and possesses a good stereochemistry. Dihedral angle values comparison of first and second complementarity-determining region (CDR) of M12-VH domain with an average value, for these two hypervariable regions, shows a significant deviation and therefore, it can be speculated that the M12-VH either suggests the existence of new canonical subclass or a link among the subclasses of canonical main-chain conformation in VH3 family. The natural existence of the stabilizing mutations Glu-H6, Arg-H66 and Ser-H52 confers the intrinsic stability to M12-VH domain under reducing conditions and therefore, the framework of this antibody domain can be used for incorporation of other specificities. This result would be helpful in structure based single domain antibody designing for biotechnological and pharmaceutical applications especially against MUC1 related cancer. The isolated VH domain undergoes aggregation due to the exposure of the hydrophobic surface involved in VH/VL interface. The camelization of the position H44, H45 and H47 can increase the hydrophilicity of the VH domain. Native and camelized M12-VH domain cloned in cytoplasmic expression vector would be helpful in assessing the immunogenic effects of camelizing the human VH domain.

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