Molekulares Targeting von Hepatischen Sternzellen zur Therapie der Leberfibrose

Benner, Susanne; Peterhänsel, Christoph

doi:HT015186765

Molekulares Targeting von Hepatischen Sternzellen zur Therapie der Leberfibrose = Molecular targeting of hepatic stellate cells for therapy of liver fibrosis

Benner, Susanne (Author)

2007

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Susanne Benner, geb. Schmitz

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangXIII, 166 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Peterhänsel, Christoph (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-03-28

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-19190
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/62272/files/Benner_Susanne.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Klinische Chemie und Pathobiochemie (526000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Leberfibrose (Genormte SW) ; Therapie (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; p53 (frei) ; CSRP2 (frei) ; Nanosphären (frei) ; Mannose 6-Phosphat (frei) ; nanospheres (frei) ; mannose 6-phosphate (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Chronische Schädigungen der Leber führen durch Aktivierung von hepatischen Sternzellen (HSC) zur Leberfibrose und in finaler Konsequenz zur Leberzirrhose. Ein Entfernen der aktivierten HSC durch Apoptose führte bei experimentell induzierten Leberfibrosen zu einer Auflösung der Fibrose. Daher war das Ziel dieser Arbeit, spezifisch in aktivierten HSC durch Überexpression von pro-apoptotischen Proteinen Apoptose auszulösen. Dazu wurden die Gene für die pro-apoptotischen Proteine p53, Bax und HSV1tk unter die Kontrolle eines humanen CSRP2-Promotorfragementes kloniert und die so erhaltenen Genkassetten in replikationsdefiziente Adenoviren zur Infektion von HSC eingebracht. Es konnte in verschiedenen Assays gezeigt werden, dass das klonierte CSRP2-p53 Konstrukt in Ratten-HSC keine signifikante Apoptose auslösen kann. Möglicher Grund hierfür könnte die in dieser Arbeit mittels verschiedener Reportergenassays gezeigte Selbst-Limitierung des Konstruktes sein. Eine weitaus drastischere Selbst-Limitierung konnte auch für das CSRP2-bax Konstrukt gezeigt werden. Darüber hinaus zeigt der hier dargestellte Homologie- und Expressions-Vergleich, dass das verwendete humane Promotorfragment in humanen HSC und solchen aus Ratten stark unterschiedlich reguliert und exprimiert wird. In Kooperation mit dem Lehrstuhl für Textilchemie und Makromolekulare Chemie der RWTH Aachen war das zweite Ziel dieser Arbeit die Analyse von mit Mannose 6 Phosphat (M6P) Liganden beladenen Poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA)-Nanosphären als spezifisches delivery-System für aktivierte HSC. Es konnte gezeigt werden, dass die einer Ratte systemisch applizierten Nanosphären nach 24 Stunden in vivo hauptsächlich in Leber und Milz akkumulierten und nicht zu tödlichen Embolien führten. Dazu durchgeführte Expressionsanalysen des M6P/IGFII-Rezeptors verschiedener Organe zeigten jedoch eine höhere Expression des Rezeptors in Herz und Muskel als in der Leber, so dass hier von einer rezeptor-unabhängigen Akkumulation der Sphären in der Leber ausgegangen werden muss. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die verwendeten Nanosphären in vitro von allen untersuchten Leberzelltypen aufgenommen wurden, bevorzugt jedoch von Kupffer-Zellen. Eine dazu durchgeführte Analyse der untersuchten Leberzelltypen auf Expression des M6P/IGFII-Rezeptors zeigte, dass der Rezeptor in allen Leberzelltypen nachgewiesen werden kann. Da weder in dieser Arbeit noch vom Hersteller der Nanosphären selbst ein zweifelsfreier Nachweis der Mannose 6-Phosphat-Ligandenbeladung erbracht werden konnte, muss jedoch auch hier von einer unspezifischen, nicht rezeptorvermittelten Aufnahme ausgegangen werden. PLGA-Nanosphären können daher in vivo als mögliches Leber-delivery-System dienen, da sie dort nach systemischer Applikation akkumulieren und -in vitro- von allen Leberzelltypen aufgenommen werden. Mit dem verwendeten humanen CSRP2-Promotorfragment kann möglicherweise in humanen HSC eine zelltypspezifische Genexpression erreicht werden, jedoch zeigen die Ergebnisse bei Verwendung des Promotorfragmentes aus der Ratte mit den Genen für die pro-apoptotischen Proteine p53 und Bax in HSC eine Selbst-Limitierung der Konstrukte. Eine Kombination des Promoterfragmentes mit dem Gen für die HSV1tk könnte in humanen HSC jedoch zum gewünschten Effekt der HSC-spezifischen Apoptoseinduktion führen und damit eine mögliche Beladung der PLGA-Nanosphären für ein spezifisches targeting der aktivierten HSC darstellen.

Chronic injury of the liver leads to liver fibrosis by the activation of hepatic stellate cells (HSC) and in final consequence to liver cirrhosis. Removal of activated HSC by apoptosis precedes fibrosis resolution in experimental induced fibrosis. Thus the purpose of this work was to induce apoptosis by overexpression of pro-apoptotic proteins in activated HSC specifically. Therefore, the genes for the pro-apoptotic proteins p53, Bax and HSV1tk were cloned under the transcriptional control of a human CSRP2-promoter fragment. Those gene cassettes have been placed in replication deficient adenoviruses to infect HSC. In different assays it has been shown, that the cloned CSRP2-p53 construct could not induce a significant apoptosis in rat HSC. One possible reason for this could be the self-limitation of this construct, which was shown by different reporter gene assays in this thesis. An even more dramatic self-limitation was also shown for the CSRP2-bax construct. Furthermore, the comparison of homology and expression shows, that the human promoter fragment is highly differentially regulated and expressed in human HSC versus rat HSC. The second aim of this thesis was the analysis of Poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanospheres with mannose 6 phosphate (M6P) ligands as a specific delivery-system for activated HSC in cooperation with the Department of Textile Chemistry and Macromolecular Chemistry of RWTH Aachen. It was shown, that in vivo systemically applicated nanospheres mainly accumulated in liver and spleen after 24 hours and did not cause lethal embolisms. Additionally performed analyses of the M6P/IGFII receptor expression in different organs however showed a higher expression of the receptor in heart and muscle cells than in the liver. Thus, the accumulation of the spheres in the liver seems not to be receptor mediated. Via confocal microscopy it was shown, that all types of liver cells incorporate the nanospheres in vitro, particularly the Kupffer cells. Yet there is no doubtless proof of the M6P ligand on the surface of the spheres, neither from the producer of the nanospheres nor in this thesis. Therefore, the observed effect seems to be an unspecific, non-receptor mediated incorporation in vitro, too. In conclusion, PLGA-nanospheres may serve as a liver specific delivery system in vivo, as they accumulate in liver after systemical application and are incorporated from every liver cell type in vitro. A HSC specific gene expression could be achieved with the studied human CSRP2 promoter fragment, but the results of different experiments with the p53 and bax genes under the transcriptional control of this promoter fragment showed a self-limitation of those constructs. However, a combination of this promoter fragment with the HSV1tk gene may lead to the intended specific induction of apoptosis in human HSC. This construct may therefore be a possible load for the PLGA-nanospheres for the specific targeting of activated HSC.

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