Nukleozytoplasmatisches shuttling des latenten und konstitutiv aktivierten Transkriptionsfaktors STAT3

Vogt, Michael; Müller-Newen, Gerhard

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-34675

Nukleozytoplasmatisches shuttling des latenten und konstitutiv aktivierten Transkriptionsfaktors STAT3 = Nucleocytoplasmic shuttling of latent and persistently activated transcription factor STAT3

Vogt, Michael

2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michael Vogt

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2010

UmfangVIII, 107 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Müller-Newen, Gerhard (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-12-06

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-34675
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/63779/files/3467.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Biochemie und Molekularbiologie (513000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Signaltransduktion (Genormte SW) ; Transkriptionsfaktor (Genormte SW) ; Konfokale Mikroskopie (Genormte SW) ; STAT (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; JAK-STAT Signalweg (frei) ; STAT3 (frei) ; iFLAP (frei) ; nukleozytoplasmatisches Shuttling (frei) ; Dimerisierung (frei) ; nucleocytoplasmic shuttling (frei) ; dimerization (frei) ; confocal microscopy (frei) ; JAK-STAT pathway (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In der intrazellulären Signaltransduktion von IL-6-Zytokinen nimmt der Transkriptionsfaktor STAT3 (signal transducer and activator of transcription) eine Schlüsselposition ein. Die Signaltransduktion erfolgt über den JAK/STAT Signalweg. Die IL-6-Bindung an den Rezeptorkomplex aktiviert Janus-Kinasen (JAK), welche Phosphotyrosinmotive im Rezeptor generieren an die STAT3 bindet. STAT3 wird durch JAKs phosphoryliert, dissoziiert vom Rezeptor, dimerisiert zum aktiven Transkriptionsfaktor. Aktivierte STAT3-Dimere translozieren in den Zellkern und induzieren Genexpression. In unstimulierten Zellen zeigt latentes STAT3 eine stationäre subzelluläre Verteilung, welche aus konstitutiven nukleären Im- und Exportprozessen resultiert. Mittels konfokaler laser scanning Mikroskopie wurde die Translokationdynamik zwischen Zellkern und Zytosol für latentes STAT3 und dauerhaft aktiviertes STAT3 im live cell imaging analysiert. STAT3 wurde mit den Fluoreszenzproteinen CFP (cyan fluorescent protein) und YFP (yellow fluorescent protein) c-terminal fusioniert (STAT3-CFP-YFP) und in Zellen exprimiert. Das nukleozytoplasmatische shuttling wurde mittels der mikroskopischen Bleichmethode iFLAP (intracatenar fluorescence localization after photobleaching) untersucht. Die Analyse der subzellulären Verteilung von endogenem STAT3 und STAT3-CFP-YFP (STAT3-CY) zeigte keine Unterschiede in der Lokalisation in unstimulierten und stimulierten Zellen. Der Nachweis der STAT3-Tyrosinphosphorylierung belegte eine vergleichbare Aktivierung von endogenem STAT3 und STAT3-CY nach Stimulation. STAT3-CY zeigt eine analoge Funktionalität wie endogenes STAT3. Um den Einfluss einer Importin-vermittelten Translokation auf das shuttling von latentem STAT3 nachzuweisen wurden Punktmutationen in einer vermuteten nukleären Lokalisationssequenz (NLS) eingeführt. Die Aminosäuren R214/R215 wurden zu Alanin mutiert (dNLS). Trotz Tyrosinphosphorylierung nach IL-6-Stimulation ist die Mutante STAT3-dNLS-CY nicht in der Lage im Kern zu akkumulieren. Für STAT3-dNLS-CY wurde mittels der iFLAP Methode eine mit STAT3-CY vergleichbare Translokationsdynamik in lebenden unstimulierten Zellen nachgewiesen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass es sich bei dieser Sequenz um keine NLS handelt. Dieser Befund stärkt die Hypothese eines Importin-unabhängigen shuttlings für latentes STAT3. In STAT3 ist der Sequenzbereich As 524-533 als nukleäres Exportsignal (NES) definiert, welches im CRM1-vermittelten nukleären Export involviert ist. Die Mutation der Aminosäuren L525/L528 zu Alanin (dNES) in der vermuteten NES führte zur Gleichverteilung der Mutante zwischen Zytosol und Kern in unstimulierten Zellen. In iFLAP Untersuchungen von STAT3-dNES-CY lässt sich im Vergleich zu STAT3-CY ein schnelleres nukleozytoplasmatisches shuttling feststellen. Dieser Befund zeigt, dass es sich bei dem postulierten NES-Motiv nicht um ein Exportsignal handelt. Für die mikroskopische Untersuchung (iFLAP) des nukleozytoplasmatischen shuttlings von aktiviertem STAT3 ist eine dauerhafte Tyrosinphosphorylierung und stationäre nukleäre Akkumulation von STAT3-CY notwendig. Dies wurde durch die Ko-Expression von dauerhaft aktivem viralem Src erreicht. Für dauerhaft aktiviertes STAT3-CY konnte ein schnelleres shuttling detektiert werden, als für latentes STAT3 in unstimulierten Zellen. Ein mathematisches Diffusions-Modell des nukleären Im- und Exports ermöglichte die Verrechnung von iFLAP Daten zu einem quantitativen Wert lambda für die Geschwindigkeit des shuttlings. Es wurde die annähernde Verdopplung der Geschwindigkeit des nukleozytoplasmatischen shuttlings für dauerhaft aktiviertes STAT3 gegenüber der von latentem STAT3 bestimmt. Anhand dieser Befunde postulieren wir einen dynamischen Reaktivierungszyklus von STAT3 durch ein beschleunigtes nukleozytoplasmatisches shuttling gegenüber dem konstitutiven shuttling in unstimulierten Zellen. Mittels nativer Gel-Elektrophorese wurde bestätigt, dass latentes STAT3 präformierte Dimere ausbildet. Der für diese intermolekulare Bindung notwendige Interaktionsbereich konnte auf die N-terminale Domäne eingegrenzt werden. Anhand der Deletionsmutante STAT3-dNt-CY wurde das nukleozytoplasmatische shuttling von latentem STAT3-Monomeren in unstimulierten Zellen analysiert. Für STAT3-dNt-CY wurde ein beschleunigtes shuttling im Vergleich zu STAT3-CY nachgewiesen. Demnach ist die Dimerisierung von latentem STAT3 keine Voraussetzung für das konstitutive nukleozytoplasmatische shuttling. Stattdessen ist anzunehmen, dass präformierte latente STAT3-Dimere den nukleären Import behindern.

The transcription factor STAT3 (signal transducer and activator of transcription) is a key player in intracellular signal transduction of IL-6 type cytokines via the JAK/STAT signaling pathway. The binding of IL-6 to the receptor complex activates Janus kinases (JAK), which phosphorylate tyrosine motifs in the cytoplasmic part of the receptor. These phosphotyrosine residues serve as docking sites for STAT3. STAT3 becomes phosphorylated by JAKs, dissociates from the receptor, dimerizes to the active transcription factor. Activated STAT3 dimers translocate into the nucleus and induce gene expression. STAT3 shows a stationary subcellular distribution in unstimulated cells, which results from constitutive nuclear import and export processes. Nucleocytoplasmic shuttling of latent and persistently activated STAT3 was analyzed by confocal laser scanning microscopy in living cells. STAT3 was C-terminally fused with the fluorescent proteins CFP (cyan fluorescent protein) and YFP (yellow fluorescent protein) (STAT3-CFP-YFP). The shuttling was investigated by the microscopic iFLAP (intracatenar fluorescence localization after photobleaching) method. Analyzing the subcellular distribution of endogenous STAT3 and STAT3-CFP-YFP (STAT3-CY) no differences in unstimulated and stimulated cells were detected. Similar activation of endogenous STAT3 and STAT3-CY after stimulation was monitored by comparable tyrosine phosphorylation. STAT3-CY shows the same functionality as endogenous STAT3. In order to investigate the impact of importin-mediated translocation on the shuttling of latent STAT3 point mutations were introduced into a presumed nuclear localization sequence (NLS). The amino acids R214/R215 were mutated to alanine (dNLS). Despite the mutant STAT3-dNLS-CY is tyrosine phosphorylated it is not able to accumulate in the nucleus after IL-6 stimulation. Comparable translocation dynamics of STAT3-CY and STAT3-dNLS-CY were detected by iFLAP in living unstimulated cells. The results indicate that the mutated sequence is not a NLS. This finding strengthens the hypothesis that nucleocytoplasmic shuttling of latent STAT3 is independent of importin. The amino acid sequence 524-533 in STAT3 was described as a nuclear export signal (NES), which is involved in the CRM1-mediated nuclear export. The mutation of the amino acids L525/L528 to alanine (dNES) in the putative NES led to an equal subcellular distribution of the mutant between cytosol and nucleus in unstimulated cells. Investigating the nucleocytoplasmic shuttling by iFLAP a faster translocation dynamic of STAT3-dNES-CY was detected compared to STAT3-CY. This finding shows that the putative NES motif is not an export signal. For microscopic examination (iFLAP) of the nucleocytoplasmic shuttling of activated STAT3 a persistent tyrosine phosphorylation and stationary nuclear accumulation of STAT3-CY is necessary. This was achieved by co-expression of constitutive active viral Src. For persistently activated STAT3-CY an accelerated shuttling was detected compared with latent STAT3 in unstimulated cells. A mathematical diffusion model of the nuclear import and export facilitated the evaluation of iFLAP data to a quantitative value lambda for the speed of the nucleocytoplasmic shuttling. The rate of nucleocytoplasmic shuttling of activated STAT3 is approximately doubled in comparison with latent STAT3. Based on these findings, we hypothesize a dynamic reactivation cycle of STAT3 through accelerated nucleocytoplasmic shuttling compared with the constitutive shuttling in unstimulated cells. Using native gel electrophoresis we confirmed that latent STAT3 forms dimers. The binding site of this intermolecular interaction could be restricted to the N-terminal domain. The nucleocytoplasmatic shuttling of monomeric latent STAT3 was analyzed by expressing the deletion mutant STAT3-dNt-CY in unstimulated cells. For STAT3-dNt-CY an accelerated shuttling was detected compared with STAT3-CY. Accordingly, the dimerization of latent STAT3 is not a prerequisite for the constitutive nucleocytoplasmatic shuttling. Instead, it is likely that preformed latent STAT3 dimers hamper the nuclear import.

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