An investigation into the characteristics and potential therapeutic application of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in experimental spinal cord injury

Montzka, Katrin; Wagner, Hermann

doi:30849

An investigation into the characteristics and potential therapeutic application of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in experimental spinal cord injury = Eine Untersuchung der Charakteristika und der potentiellen therapeutischen Anwendung humaner, aus dem Knochenmark gewonnener, mesenchymaler Stromazellen in experimentellen Rückenmarksverletzungen

Montzka, Katrin (Author)

2011

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Katrin Montzka

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangIII, 106 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wagner, Hermann (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-08-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-37744
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/64325/files/3774.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Nervenregeneration (Genormte SW) ; Biomaterial (Genormte SW) ; Tissue Engineering (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; mesenchymale Stromazellen (frei) ; Wachstumsfaktoren (frei) ; nerve regeneration (frei) ; biomaterials (frei) ; tissue engineering (frei) ; mesenchymal stromal cells (frei) ; growth factors (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Transplantierte mesenchymale Stromazellen (MSZ) sind in der Lage die funktionelle Regeneration nach Rückenmarksverletzungen zu verbessern. Die verantwortlichen Mechanismen für diesen Effekt sind jedoch weitgehend unbekannt. Die ersten Studien über die Transplantation von MSZ in Läsionen des Rückenmarks zeigten eine Differenzierung der Spenderzellen in eine neurale Linie. Dieses so genannte Transdifferenzierungsvermögen rief enorme Aufregung aber auch große Skepsis hervor. Andere Studien kamen zu dem Schluss, dass der postive Effekt durch einen parakrinen Mechanismus hervorgerufen wird. Diese Dissertation wurde erstellt, um Einblicke in die Eigenschaften von MSZ sowie deren Schicksal und Funktion nach der Transplantation in Rückenmarksverletzungen zu erhalten. Es konnte festgestellt werden, dass humane MSZ (hMSZ) grundsätzlich einige neurale Marker exprimieren, eine Eigenschaft die andere Gruppen dazu verleitet haben mag zu folgern, dass hMSZ in eine neurale Linie transdifferenzieren können. Interessanterweise konnte nachgewiesen werden, dass diese Marker eine Spender-abhängige Variabilität aufweisen, die die weitgehend unterschiedlichen Meinungen über die Transdifferenzierung von hMSZ beeinflusst haben könnte. Die klinische Anwendung von hMSZ erfordert die Expansion der isolierten Zellen in entsprechender Anzahl ohne die Ergänzung von tierischem oder humanem Serum. Die konventionelle Expansion beinhaltet jedoch die Verwendung von 10% fötalem Kälberserum (FKS), welches infektiöse Erreger übertragen oder zu einer immunologischen Abstoßungsreaktion der transplantierten Zellen führen könnte. In der vorliegenden Dissertation wurde die Isolation und Expansion von hMSZ ohne Ergänzung von Serum angestrebt, konnte jedoch nicht erzielt werden. Allerdings konnte im Vergleich zum konventionellen Medium eine signifikant bessere Proliferation mit der Ergänzung von nur 2% FKS und bestimmten Wachstumsfaktoren erreicht werden. Die Multipotenz der hMSZ wurde durch die Verwendung dieses Serum-reduzierten Mediums nicht beeinflusst. Da die förderlichen Eigenschaften der hMSZ Transplantation in Rückenmarksverletzungen die Folge von parakrinen Mechanismen zu sein scheinen, wurde das Expressionsmuster verschiedener Wachstumsfaktoren und Zytokine untersucht. Unbehandelte hMSZ als auch hMSZ die mit Lipopolysacchariden (LPS) behandelt wurden, wiesen eine Spender-abhängige Variabilität auf. Um die Möglichkeit zu untersuchen, ob hMSZ ihr spezifisches Expressionsmuster nach Implantation in zerstörtes Rückenmarksgewebe ändern können, wurden hMSZ mit Homogenaten von gesundem sowie verletztem Rückenmark von Ratten ko-kultiviert. Um weiterhin feststellen zu können, ob eine solche Änderung gewebsspezifisch ist, wurden zusätzlich Homogenate von gesundem und geschädigtem Herzgewebe von Ratten verwendet. Keines der genannten Homogenate war in der Lage die individuellen Muster der Wachstumsfaktor- und Zytokin-Expression zu verändern, was darauf schließen lässt, dass die individuellen Expressionsmuster der hMSZ nach Implantation in geschädigtes Rückenmark unverändert bleibt. Eine solche spenderabhängige Variabilität kann jedoch den Grad einer folgenden funktionellen Regeneration weitreichend beeinflussen und es muss in Betracht gezogen werden, dass manche Spenderproben nicht die geeigneten Wachstumsfaktor- und Zytokin-Expressionsmuster für eine optimale Geweberegeneration aufweisen. Ein Hauptaspekt der vorliegenden Dissertation war die Evaluation einer auf hMSZ-basierenden Tissue Engineering Strategie, die orientiertes axonales Wachstum und funktionelle Geweberegeneration in einem experimentellen Tiermodell der akuten Rückenmarksverletzung fördert. Hierfür wurden von einem Kooperationspartner hMSZ mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) transduziert, um eine Identifikation der transplantierten Zellen zu ermöglichen. Diese Zellen wurden in orientierten Kollagen-Trägermatierialien ausgesät und in Hemisektionen des thorakalen Rückenmarks implantiert. Schon nach 1 Woche zeigten Tiere, die hMSZ-besiedelte Trägermaterialien implantiert bekamen, eine deutliche funktionelle Verbesserung im Vergleich zu den Kontrolltieren. Des Weiteren zeigten die Verhaltensanalysen eine signifikante funktionelle Verbesserung im Vergleich zu den Kontrolltieren 4 Wochen nach Implantation, aber ohne Signifikanz nach 8 Wochen. Immunhistochemische Untersuchungen belegten, dass nur eine geringe Anzahl der transplantierten hMSZ bis zum Ende von 8 Wochen nach Implantation überlebt hatten. Dennoch wiesen die Tiere, die hMSZ besiedelte Trägermaterialien erhalten hatten, eine erhöhte Anzahl regenerierter Axone sowie eine reduzierte astrozytische und inflammatorische Reaktion auf. Interessanterweise exprimierten die Spender-hMSZ Chondroitinsulfat-Proteoglycane (CSPG) und obwohl nur wenige lebende Zellen detektiert wurden, konnten CSPG Ablagerungen im gesamten Trägermaterial nachgewiesen werden. Folglich ist es sehr wahrscheinlich, dass die regenerativen Eigenschaften der hMSZ von der Expression von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und extrazellulären Matrixmolekülen herrühren, die ihrerseits in der Lage sind ansässige und eindringende Zellen zu beeinflussen.

Transplanted mesenchymal stromal cells (MSC) have been reported to improve functional recovery after spinal cord injury (SCI). The mechanism(s) responsible for this effect are, however, largely unknown. The first studies about MSC transplantation into spinal cord lesions reported differentiation of the donor cells to a neural lineage. This so-called transdifferentiation capacity has aroused great excitement as well as great scepticism. Other studies suggested that the beneficial effects were due to a paracrine mechanism. This thesis was designed to provide insights into the properties of MSC as well as into their fate and function after transplantation into spinal cord lesions. Human MSC (hMSC) were found to constitutively express several neural-related markers, a property which may have led other groups to conclude that hMSC were capable of transdifferentitation to a neural lineage. Interestingly, these markers demonstrated a donor-dependent variability which may have influenced the widely differing opinions about hMSC transdifferentiation. Clinical application of hMSC requires the expansion of isolated cells to relevant numbers without supplementation of animal- or donor-derived serum. Conventional expansion, however, includes the employment of 10% fetal bovine serum (FBS) which might transfer infectous agents or might lead to the immune rejection of transplanted cells. The isolation and expansion of hMSC in the absence of serum supplementation was attempted in the present thesis but could not be accomplished. However, significantly better proliferation could be achieved with supplementation of only 2% FBS and certain growth factors compared to the conventional medium. The multipotent capacity of hMSC was found to be unaffected by the employment of this serum-reduced medium. Since the beneficial effects of hMSC transplantation into SCI were thought to be due to paracrine mechanisms, the expression patterns for several growth factors and cytokines were investigated. A donor-dependent variability of expression could be demonstrated in untreated hMSC as well as in hMSC that had been exposed to lipopolysaccharide (LPS). To investigate the possibility that hMSC could change their specific expression pattern when implanted into debris-laden spinal cord lesions, hMSC were co-cultivated with tissue homogenates from normal and injured rat spinal cords. To determine if this possibility might be tissue specific, homogenates from normal and infarcted rat heart were also applied. None of the above homogenates were found to change the individual donor-dependent patterns of growth factor- or cytokine expression suggesting that indivual hMSC expression patterns remained unaltered following implantation into the lesioned spinal cord. However, such donor-dependent variability might have a profound influence on the degree of subsequent functional recovery and it has to be considered that some donor samples might not have the appropriate growth factor and cytokine expression profiles for optimal tissue repair. A major aspect of the present thesis was the evaluation of an hMSC-based tissue engineering strategy to promote orientated axonal re-growth and functional tissue repair in an experimental animal model of acute SCI. Therefore, cooperation partners transduced hMSC to express green fluorescent protein (GFP) to enable identification of transplanted cells. These cells were seeded into oriented 3D collagen scaffolds and implanted into thoracic spinal cord hemisections. Already 1 week after implantation, animals which received hMSC-seeded scaffolds demonstrated better functional improvement than the control animals, which was even significant after four weeks. This difference, however, was no longer significant at 8 weeks. Immunohistochemistry revealed that only small numbers of transplanted hMSC had survived up to the termination date of 8 weeks after implantation. Nonetheless, animals receiving hMSC-seeded scaffolds demonstrated increased numbers of regenerating axons as well as reduced astrocytic and inflammatory responses. Interestingly, donor hMSC were found to express chondroitin sulphate proteoglycans (CSPG) and although few viable cells could be detected, CSPG deposits could be observed throughout the scaffold. In conclusion, it is likely that hMSC exert their regenerative properties by the expression of growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules which are capable of influencing resident and invading cells.

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