Optical control of primary rat cortical neural activity in vitro

Jin, Lei; Spehr, Marc; Offenhäusser, Andreas

doi:HT019045658

Optical control of primary rat cortical neural activity in vitro = Kontrolle neuronaler Aktivität in vitro von primären Kortexzellen der Ratte durch optische Methoden

Jin, Lei

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science in Biology Lei Jin

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (VI, 113 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor) ; Spehr, Marc (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-056790
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660950/files/660950.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/660950/files/660950.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Optogenetics (frei) ; recombinant adeno-associated virus (rAAV) (frei) ; human synapsin (hSyn) promoter (frei) ; Channelrhodopsin 2 variant ChR2opt (frei) ; ChR2-XXL (frei) ; Naturally occurring anion channelrhodopsin (GtACR1) (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Entdeckung des Channelrhodopsins (ChRs) erlaubt davon Einsatz in den Neurowissenschaft, an der so gennanten Optogenetics. Die Aktivität von Nervenzellen kann hierbei stimuliert oder gedämpft werden. Aktuell wird Optogenetics eingesetzt, um neuronale Schaltkreise, die mit spezifischem Verhalten oder neurologischen Krankheiten verbunden sind, zu erforschen. Jedoch sind noch viele Fragestellungen offen, z.B. wie ChR2 Gene in spezifische Zelltypen eingebracht werden können, und ob weiter Proteine als stärkere oder effizientere Optogenetic-Werkzeuge eingesetzt werden können. Im ersten Teil meiner Arbeit werden rekombinante adeno-assoziertes Viren (rAAV) in verschiedene Serotypen für ihre Transduktionfähigkeit in Neuronen getestet. rAAV6 wurde dabei als der effizienteste Serotyp zur Transduktion von Kulturen mit kortikalen und glial Zellen identifiziert. Zuerst wurde der konstitutive aktive Cytomegalovirus (CMV) Promotor benutzt ChR2opt (eine Variante von Channelrhodopsin 2) Genexpression zu betreiben. Das Protein konnte sowohl in Neuronen als auch in Gliazellen nachgewiesen werden. Anschließend wurde der CMV-Promotor gegen den humanen Synapsin (hSyn) Promotor ausgetauscht, um ChR2opt Expression auf Neuronen zu beschränken. Bemerkenswert ist, dass ich durch die Verwendung von blauem Licht die elektrische Aktivität in ChR2opt exprimierenden, primären kortikalen Neuronen steuern und erfolgreich Aktionspotentiale durch ChR2opt Stimulation induzieren konnte. Aktionspotentiale wurden dabei in rAAV transduzierten Zellen schneller ausgelöst als zuvor in transfizierten Zellen berichtet. Mit dieser Strategie habe ich die Aktivität auf der Einzelzellebene mit hoher Zeitauflösung kontrolliert.Mit Benutzung dieses rAAV6-hSyn-ChR2opt, der ihn zweitem Teil diese Thesis erklärt wird gelang ervolkreiche Steuerung von zufällig und gemusterten neuronalen Netzwerken in vitro. In beide Netzwerken waren kortikal Microschaltkreisen optogenetisch erforscht. Die Benutzung von zwei verschiedenen verzweigtes Muster, erlaubt die optische Steurerung der neuronalen Aktivität auf Ebene der Einzelzelle. Auf die verzweigt Muster, Lichtstimulation über nur eine kleine Membranfläche von ein Axon oder Dendrit stärk genug war Aktionpotentialen zu auslösen. Diese Ergebniss sind die nächste Schritten für höhre Auflösung der neuronalen Aktivitätssteuerung. Der dritte Teil meiner Thesis zeigt ein neues, mächtiges, optogenetisches Protein (ChR2-XXL), in primär kortikalen Neuronen der Ratte in vitro mit sehr hoher Lichtempfindlichkeit, langer Kanalöffnungsdynamik, und starkem induziertem Lichtstrom. Zwei wichtige Eigenschaften wurden durch Ganzzellenpatchclamp und Beleuchtung mit blauen Laserlicht in Neuronen bestätigt; auf der einen Seite, daß Neuronen mit ChR2-XXL durch dauerhafte Depolarization blockiert werden, auf der anderen Seite daß Neurotransmission erfolgreich induziert wurde, wenn die präsynaptische Zelle mit ChR2-XXL stimuliert wurde.Der letzte Teil meiner Arbeit erklärt die Benutzung eines Anion Channelrhodopsins aus Algae (GtACR1) in primär kortikalen Neuronen der Ratte. Es wurde bestätigt, daß GtACR1 auch in primären Neuronen als ein lichtsteuerbarer Chlorkanal funktioniert. Damit wurde neuronale Aktivität, z.B. elektrisch stimuliert, und spontane Aktionspotentiale durch Blaulichtbeleuchtung unterdrückt. Darüber hinaus zeigt meine Arbeit dass die Konzentration von Cl- während neuronaler Entwicklung fällt. Dieser Beweis zeigt, dass GtACR1 möglicherweise nicht nur ein Weg ist neuronale Aktionspotentiale zu minimieren, auch diese von spontaner Netzwerkaktivität, sondern auch benutzt werden könnte Cl- bassierte Entwicklungsprozesse zu manipulieren.Zusammengefaßt ist meine Arbeit der Grundstein für zwei Themen. Erstens, das rAAV6 verpackte und mit hSyn Promoter getriebene Genekonstrukt ist ein wertvolles System für die Auswertung Zellularmikroschaltkreise und die Steuerung der neuronalen Aktivität. Wenn dieses System ChR2opt Produktion betreibt, erlaubt es die Manipulation von zufälligen und gemusterten Netzwerken mit Genauigkeit bis zu einzelnen Neuriten. Zweitens, neue Proteine wurden für ihre Benutzung in Neuronen validiert. ChR2-XXL konnte stabil eine Depolarizationsperre generieren und Neurotransmission ändern. Auch ACRs sind ein System für schnelle und effiziente Unterdrückung von Neuronalaktivität durch Hyperpolarization. Diese neuen optogenetischen Proteine, und der durch rAAV optimiert Genlieferungsmethode sind attraktive Systeme für zukünftige optogenetische Beeinflussung in vivo.

The discovery of Channelrhodopsins (ChRs) allows their application in the field of neuroscience, so called optogenetics, for exciting or inhibiting neuronal activity. Nowadays optogenetics technology is very promising for decoding neuronal circuits associated with specific behaviors, as well as neurological disorders. However, many questions still need to be addressed, such as the lack of cell type-specific gene transfer methods for ChRs delivery or powerful and more efficient optogenetic tools. In the first part of my thesis, recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotypes are screened for their ability to transfer genes to neurons. rAAV6 was identified as the most efficient serotype for transduction of cortical-glial mixed cultures. First, we used the constitutively active cytomegalovirus (CMV) promoter to drive gene expression of the Channelrhodopsin 2 variant ChR2opt. The protein was detected in neurons as well as in glia cells. After exchanging the CMV promoter for the human synapsin (hSyn) promoter, ChR2opt expression was restricted to neurons. Notably, using blue light illumination, I could control electrical activity in primary cortical neurons expressing ChR2opt and succeeded in triggering action potentials by ChR2opt stimulation. Using this strategy, I was able to register responses at the single cell level with high temporal accuracy. Based on the system of rAAV6-hSyn-ChR2opt investigated in the first part, the second part successfully achieved optical control of neuronal networks with both random and patterned connectivity in vitro. In both networks, optogenetic mapping of cortical microcircuits was performed. Most important, using two kinds of branched patterns with defined structure, optical control of neural activity at the single cell level was successfully achieved. Only stimulating the small area of axons or dendrites was sufficient to effectively elicit action potentials in the branched patterns. These results provide the next steps in increasing the resolution of optical control of neuronal activity. In the third part of my thesis, one novel powerful tool with super light-sensitivity, long open-state and large photocurrent, termed ChR2-XXL, was employed in primary rat cortical neurons in vitro. Its two important features have been confirmed in neurons with whole cell patch clamp together with blue laser illumination. On the one hand, stable depolarization block could be achieved in ChR2-XXL expressing neurons; on the other hand, neurotransmission can be successfully induced when stimulating the presynaptic neurons that expressed ChR2-XXL. The last part addressed a naturally occurring anion channelrhodopsin (GtACR1) in primary rat cortical neurons. Light-gated chloride conduction of GtACR1 was verified in primary cortical neurons. Subsequently, the efficient photosuppression of neuronal action potentials, including electrically stimulated and spontaneous activity, was performed using blue laser illumination. In addition, my work implies that the chloride concentration in neurons decreases during neural development. This work provides strong evidence that GtACR1 can not only inhibit neuronal signals, including spontaneous activity, but may also be used to manipulate Cl- based cell maturation systems.In summary, my work offers strong evidence to support two main aims. First, rAAV6 with hSyn promoter driven constructs provides a useful tool for specifically manipulating neuronal activity and mapping microcircuits. Employing this system to express ChR2opt, allowed both random and patterned networks to be manipulated with specificity of stimulation down to single neurites. Second, new tools have been validated for use in neurons. ChR2-XXL is able to generate stable depolarization block and shape powerful neurotransmission. Also, ACRs provide a method to achieve the rapid and efficient suppression of neuronal activity by hyperpolarization. These new tools, and the optimized method of gene transfer are promising candidates for in vivo applications of optogenetic control.

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