Generation and evaluation of a multi-stage multi component malaria vaccine cocktail produced in Nicotiana benthamiana

Boes, Alexander; Fischer, Rainer; Pradel, Gabriele

doi:35591

Generation and evaluation of a multi-stage multi component malaria vaccine cocktail produced in Nicotiana benthamiana = Generierung und Charakterisierung eines Multistadien-Multikomponenten Malaria-Impfstoff-Cocktails hergestellt in Nicotiana benthamiana

Boes, Alexander

2016 & 2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Ingenieur (FH) Alexander Boes

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (133 Blätter) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2017

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH* ; Pradel, Gabriele (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-04-15

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2017-007697
DOI: 10.18154/RWTH-2017-00769
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/682269/files/682269.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/682269/files/682269.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
molecular farming (frei) ; malaria (frei) ; vaccine (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Trotz intensiver Forschung steht derzeit noch kein hochwirksamer Malaria Impfstoff zur Verfügung. Unterschiedliche Proteine aus den verschiedenen Stadien des Plasmodium falciparum Lebenszykluses wurden als Impfstoffkandidaten evaluiert, jedoch erfüllte bislang keiner dieser Kandidaten die Erwartungen. Kombinationen von Schlüsselantigenen eines Lebenszyklusstadiums oder „Multistadien“ Impfstoff Cocktails, welche vielversprechende Antigene aus verschiedenen Lebenszyklusstadien des P. falciparum Parasiten beinhalten, könnten daher essentiell für die Entwicklung wirksamer Malaria Impfstoffe werden. Zudem müssen Impfstoffe gegen armutsbedingte Krankheiten, insbesondere Malaria, kostengünstig sowie in großen Mengen für Massenimpfkampagnen hergestellt werden. Die Agrobacterium tumefaciens basierte transiente Proteinexpression in Pflanzen bietet eine schnelle und kostengünstige Proteinproduktionsplattform, die in Bezug auf Flexibilität und Skalierbarkeit diesen Anforderungen gerecht werden kann. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die beiden wichtigsten Aspekte der Malaria Impfstoffentwicklung, neuartige Malaria Impfstoff Cocktails sowie die Eignung des pflanzlichen Expressionssystem zur kostengünstigen Produktion von Impfstoffen in großen Mengen, adressiert und ein in Pflanzen produzierter „Multistadien-Multikomponenten“ Malaria Impfstoff Cocktail detailliert charakterisiert. Zu Beginn wurde sowohl ein präerythrozytärer Malaria Impfstoffkandidat, ein Fusionsprotein (CCT) bestehend aus PfCelTos sowie den TSR -Domänen von PfCSP und PfTRAP, als auch Varianten eines führenden Blutstadium Impfstoffkandidaten (PfAMA1) in N. benthamiana produziert (Akkumulationslevel von bis zu 1,5 mg/g Blattfrischgewicht) und deren Impfstoffpotential in in vitro-Analysen nach Immunisierungen von Mäusen (CCT) bzw. Kaninchen (PfAMA1) ausgewertet. Es wurden Inhibitionen von 35% im präerythrozytären Stadium und bis zu 90% im Blutstadium beobachtet. Anschließend wurde ein Multistadien-Multikomponenten Malaria Impfstoff Cocktail (PlasmoMix) durch die Kombination der beiden Impfstoffkandidaten CCT und PfAMA1 sowie der zwei zusätzlichen Fusionsproteine E3 (Blutstadium) und F0 (sexuelles Stadium) generiert. Während das Fusionsprotein E3 EGF-ähnliche Domänen aus den Antigenen PfMSP1, PfMSP4, PfMSP8 sowie ein Fragment von PfMSP3 kombiniert, besteht das Fusionsprotein F0 aus den für das sexuelle Parasitenstadium charakteristischen Antigenen Pfs25 und dem C0 Fragment von Pfs230. Nach der Immunisierung von Kaninchen mit PlasmoMix wurden die Immunantworten gegen den Impfstoff Cocktail sowie gegen dessen Komponenten (CCT, PfAMA1, E3 und F0) und Einzelantigene/ Domänen analysiert. Des Weiteren wurden in den gereinigten Gesamt-Antikörperfraktionen die jeweiligen Komponenten-spezifischen Antikörperkonzentrationen durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Spektroskopie quantifiziert und mit der gemessenen in vitro Parasiteninhibition korreliert. Dabei wurden Inhibitionen von 80% (präerythrozytäres Stadium), 90% (Blutstadium) und 100% (sexuelles Stadium) beobachtet und deutliche Unterschiede bei den IC50 Werten festgestellt. Während die IC50 Werte für das präerythrozytäre Stadium (17-25 µg/ml) und das Blutstadium (33 45 µg/ml) vergleichbar sind, ist der IC50-Wert für das sexuelle Stadium mehr als zehnfach niedriger (1,75 µg/ml). Die in dieser Arbeit durch die detaillierten Analyse des Malaria Impfstoff Cocktails PlasmoMix generierten Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die Entwicklung der nächsten Generation von Multistadien-Multikomponenten Malaria Impfstoff Cocktails (z.B. VaxDrIME), die vor allem die Polymorphismen in den Blutstadiumantigenen berücksichtigen sollen. Zudem gibt diese Studie Hinweise darauf, dass die verschiedenen Impfstoffkomponenten nicht zwangsläufig in gleichen Mengen, sondern eher in optimalen Verhältnissen gemischt werden sollten, um eine "ausgewogene Wirksamkeit" unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Parasitenstadium-spezifischen IC50 Anforderungen zu erzielen.

Despite decades of intensive research efforts there is currently no vaccine available that provides sterile immunity against malaria. Various proteins from different stages of the Plasmodium falciparum life cycle have been evaluated as vaccine candidates but none of them have fulfilled the expectations. Therefore, combinations of key antigens from a single life cycle stage or multi stage vaccine cocktails comprising promising antigens selected from different life cycle stages of the Plasmodium falciparum parasites may be essential for the development of efficacious malaria vaccines. Additionally, vaccines targeting poverty related diseases, and especially malaria, have to be produced at a low cost as well as in large quantities for mass immunization campaigns. The Agrobacterium tumefaciens-based transient expression in plants has emerged as a fast and low-cost protein production system that fulfil these requirements in terms of flexibility and scalability. Both crucial aspects of malaria vaccine development (novel vaccine cocktails and low cost vaccine production in large quantities) have been addressed in the present PhD thesis and the detailed characterization of a plant derived multi stage multi component malaria vaccine cocktail is described. In the first part of the PhD thesis, single stage malaria vaccine candidates either a fusion protein (CCT comprising PfCelTos, the TSR domains of PfCSP and PfTRAP, a pre-erythrocytic stage malaria vaccine candidate) or variants of a leading blood stage vaccine candidate (PfAMA1) were produced at high levels up to 1.5 mg/g FLW in N. benthamiana and their vaccine potential was evaluated in stage-specific in vitro assays after mice (CCT) or rabbit (PfAMA1) immunization studies. Inhibition in the pre erythrocytic stage of 35% were determined for antibodies induced by CCT immunization and antibodies against PfAMA1 reduced the growth of the blood stage parasites by 90%. In the second part, a multi-stage multi-component malaria vaccine cocktail (PlasmoMix) was generated by combining both promising vaccine candidates (CCT and PfAMA1) and two additional fusion proteins E3 (blood stage) and F0 (sexual stage). The fusion protein E3 comprises EGF like domains from the blood stage antigens PfMSP1, PfMSP4 and PfMSP8 as well as a fragment of PfMSP3 and the F0 sexual stage vaccine candidate comprises the well characterized antigens Pfs25 and the C0 fragment of Pfs230. After rabbit immunization studies, the immune response against the multi-stage multi-component malaria vaccine cocktail as well as against the components (CCT, PfAMA1, E3 and F0) and all single antigens/domains were analyzed. Furthermore, the component-specific antibodies in the purified total antibody preparations were quantified by calibration-free concentration analysis (CFCA) using surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy and correlated with the observed stage-specific in vitro inhibition. Maximum inhibition values of 80% (pre erythrocytic stage), 90% (blood stage) and 100% (sexual stage) were detected with noticeable differences in the IC50-values. While the IC50 values for the pre-erythrocytic stage (17-25 µg/ml) and the blood stage (33-45 µg/ml) are comparable the IC50 values for the sexual stage is more than ten times lower (1.75 µg/ml). The results from the detailed analysis of the PlasmoMix vaccine cocktail provided valuable insights in the development of next-generation malaria vaccine cocktails (VaxDrIME) which should especially circumvent the hurdles of blood stage antigen polymorphisms and the study indicated that the different components should not be mixed in equal amounts but in optimal ratios to generate what may be called “balanced efficacy” by taken into account the different stage-specific IC50 requirements.

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