Generation and characterization of angiogenin mutants as improved effector domains for H22(scFv)-based cytolytic fusion proteins

Cremer, Christian; Fischer, Rainer; Carloni, Paolo

doi:35618

Generation and characterization of angiogenin mutants as improved effector domains for H22(scFv)-based cytolytic fusion proteins = Generierung und Charakterisierung von Angiogenin Mutanten als verbesserte Effektordomänen für H22(scFv)-basierte zytolytische Fusionsproteine

Cremer, Christian^RWTH*

2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologe Christian Cremer

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (viii, 123 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor) ; Carloni, Paolo (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-01-13

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-02415
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/685653/files/685653.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/685653/files/685653.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
angiogenin (frei) ; RNH1 (frei) ; site-directed mutagenesis (frei) ; effector domain (frei) ; cytolytic fusion protein (frei) ; targeted therapy (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Humane zytolytische Fusionsproteine (hZFP) weisen aufgrund ihrer humanen oder humanisierten Komponenten eine verringerte Immunogenität als herkömmliche Immuntoxine (IT) auf, zeichnen sich in der Regel jedoch auch durch eine geringere Wirksamkeit aus. Mittels gerichteter Modifizierung in ihrer Wirksamkeit verbesserte ZFPs stellen deshalb eine vielversprechende Alternative zu konventionellen Immuntoxinen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob das zytotoxische Potential der humanen Ribonuklease Angiogenin (Ang) durch zielgerichtete Mutagenese verbessert werden kann. Ang wird zytoplasmatisch durch das Protein RNH1 inhibiert, verfügt über eine geringe Enzymaktivität und kann im Nukleus von Zellen akkumulieren. In der Literatur konnten wir verschiedene Ang-Mutationen identifizieren, welche auf die genannten Limitierungen abzielen und die im Zuge von Kristallisierungs- und Neovaskularisierungsstudien sowie in vitroExperimenten charakterisiert wurden. Verglichen mit dem Wildtyp-Protein könnten entsprechende Mutanten ein erhöhtes zytotoxisches Potential aufweisen, sofern die beschriebenen Effekte durch die Fusion mit einer Bindekomponente erhalten bleiben. Entsprechende Mutanten wurden auf Basis der Ang-Wildtyp-Sequenz generiert und mit dem CD64-spezifischen Antikörperfragment H22 fusioniert, um deren Zytotoxizität zu ermitteln. ZFPs, welche die Effizienz des Wildtyp-basierten Fusionsproteins übertrafen, wurden detailliert charakterisiert, um die individuellen Beiträge einzelner Eigenschaften zu bestimmen. Darüber hinaus wurden vorteilhafte Mutationen kombiniert und auf kooperative Effekte hin untersucht. Molekulardynamik-Simulationen halfen dabei, individuelle Interaktionen zwischen Ang-Mutanten und RNH1 auf atomarer Ebene darzustellen. Abschließend wurde auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse die Generierung einer Variante angestrebt, welche über eine Kombination verschiedener vorteilhafter Charakteristika verfügt. In Fusion mit H22 konnten zwei der hier generierten Ang-Varianten die Zytotoxizität des Wildtyp-Proteins gegenüber HL-60 Zellen und entzündlichen Makrophagen signifikant übertreffen. Die Varianten verfügen über eine stark verringerte Affinität gegenüber RNH1 oder kombinieren eine reduzierte Affinität mit einer verbesserten Enzymaktivität. Darüber hinaus konnte eine der Mutanten leukämische Zellen mit einer vergleichbaren Effizienz wie ein Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A-basiertes IT eliminieren. Die Kombination einer artifiziellen Translokationsdomäne und einer Ang Mutante erwies sich nicht als vorteilhaft.

Human cytolytic fusion proteins (hCFPs) are a new class of anti-cancer drugs that are usually less cytotoxic than former generations of immunotoxins (ITs) but feature a strongly reduced immunogenic potential due to their human or humanized components. Thus, the directed modification of CFPs to increase their efficacy represents a promising strategy. The goal of this doctoral thesis was to investigate if the cytotoxicity of the human ribonuclease angiogenin (Ang) can be increased by modifying adverse enzymatic properties by site-directed mutagenesis. Characteristics that limit the pro-apoptotic potency of Ang as effector domain are its weak enzymatic activity, its strong cytosolic inhibition by the ribonuclease inhibitor RNH1 and its rapid accumulation in the nucleus under certain cellular conditions. By literature research, we identified promising mutations referring to the Ang wild type protein. They were either characterized by in vitro assays or revealed from crystallographic and neovascularization studies. Since these mutations abolish the above-mentioned limitations, they might be suitable to increase the cytotoxic potential of Ang as effector domain in cytolytic fusion proteins. As a proof-of-concept, the mutations were introduced into the Ang wild type sequence by sitedirected mutagenesis and the different variants were fused to the CD64-specific antibody fragment H22(scFv) for subsequent evaluation. The CFPs were tested for an increased in vitro cytotoxicity compared to H22-Ang wild type and favorable mutants underwent detailed characterizations to reveal the contribution of individual enzymatic properties. Promising mutations were combined to test if cooperative or synergistic effects may be achieved whereas molecular dynamic simulations revealed detailed insights into the individual interactions of Ang variants and RNH1. Based on this knowledge, the generation of a variant with increased substrate cleavage activity and decreased inhibition susceptibility compared to the wild type was aimed as the overall objective. In this work, two Ang variants were generated that outperformed the in vitro cytotoxicity of Ang wild type on IFNγ-stimulated HL-60 cells and pro-inflammatory macrophages substantially in fusion to H22. They either combined an improved substrate cleavage activity with a reduced RNH1 affinity or were almost resistant towards the inhibitor. One variant even demonstrated a cytotoxicity similar to a Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-based IT on leukemia cells ex vivo. The incorporation of a synthetic translocation sequence into a CFP did not further improve the cytotoxicity.

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