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Fermentation process for recombinant protein production in Komagataella phaffii = Fermentationsprozess zur rekombinanten Proteinproduktion mit Komagataella phaffii
2025
Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2025
Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
Genehmigende Fakultät
Fak04
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-06-26
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-05775
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1013898/files/1013898.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Komagataella phaffii (frei) ; Pichia pastoris (frei) ; fermentation process (frei) ; process modeling (frei) ; protein production (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620
Kurzfassung
Komagataella phaffii (K. phaffii), früher bekannt als Pichia pastoris, hat sich zu einem weit verbreiteten und robusten biotechnologischen Plattformorganismus entwickelt, mit dem rekombinante Proteine und andere Bioprodukte von kommerziellem Interesse hergestellt werden können. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Bioprozesses für die großtechnische Produktion rekombinanter Proteine in K. phaffii, wobei der Schwerpunkt auf den Medien, dem Fermentationsprozess und der Produkt Aufreinigung lag. Ein wesentlicher Vorteil von K. phaffii ist das Wachstum auf einfachen, chemisch definierten Mineralmedien, in Bioprozessen aufgrund ihrer gleichbleibenden Zusammensetzung bevorzugt werden. Bei erhöhten pH-Werten führen diese Medien jedoch häufig zur Bildung von Präzipitaten. Der Niederschlag wurde als Struvit identifiziert. Die Arbeit zeigte, dass Struvit unter typischen Fermentationsbedingungen wieder aufgelöst werden kann, wobei die Partikelgröße die Auflösungsgeschwindigkeit und damit die Nährstofffreisetzung erheblich beeinflusst. Es ist sicherzustellen, dass die Auflösungskinetik schneller ist als die Wachstumskinetik ist. Weiterhin wurde ein modellbasierter Ansatz basierend auf der Monod-Kinetik entwickelt, um die Feed-Strategien für den Prozess zu optimieren und die Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) sowie Produktkonzentrationen zu erhöhen. Die spezifische Produktivität und der Sauerstoffbedarf wurden aus experimentellen Daten abgeleitet, welche in kontinuierlichen Fermentationen gewonnen wurden. Das Modell berücksichtigt auch physikalische Einschränkungen wie die maximale Sauerstofftransferkapazität. Die Validierung anhand experimenteller Daten ergab eine gute Übereinstimmung. Darüber hinaus behandelt diese Arbeit das Auftreten einer Exopolysaccharid-Verunreinigung im Überstand bei K. phaffii Fermentationsprozessen. Es wurde festgestellt, dass diese Verunreinigung mit einer Mutation im HOC1-Gen verbunden ist und unabhängig von Substrat oder Proteinproduktion auftritt. Schließlich untersuchte die Arbeit die Auswirkungen der Glukose-Feed-Strategien auf die Bildung von Überschussmetaboliten wie Ethanol in K. phaffii Fermentationen. Hohe Glukosekonzentrationen führten zu erheblicher Ethanol Akkumulation, welche den Biomasseertrag und die Produktbildung verringerten. Durch die Optimierung der Glukosekonzentration und der Fütterungsstrategie konnte die Bildung von Überschussmetaboliten deutlich reduziert werden, was sowohl den Biomasseertrag als auch die Produktkonzentration verbesserte.Komagataella phaffii (K. phaffii), formerly known as Pichia pastoris has emerged as a common and robust biotechnological platform organism, to produce recombinant proteins and other bioproducts of commercial interest. This thesis aimed to develop a bioprocess for large-scale recombinant protein production in K. phaffii, focusing on the media, the fermentation process, and product purification. Starting with the media, a key advantage of K. phaffii is growth on simple chemically defined mineral media. These media are preferred in bioprocesses due to their consistent composition, which minimizes batch-to-batch variation. However, at elevated pH values, these media often lead to precipitate formation. The precipitate was identified as struvite, a low-solubility salt that binds key macronutrients. This research demonstrated that struvite can be redissolved under typical fermentation conditions, with particle size significantly influencing the dissolution rate and thus nutrient release. Therefore, struvite formation should be always considered in media development to ensure that dissolution kinetics are faster than the growth kinetics, preventing nutrient limitations. Furthermore, a model-based approach incorporating Monod kinetics was developed to optimize feeding strategies, aiming to enhance space-time yield (STY) and product concentrations to minimize protein production costs. Specific productivity and oxygen demand were derived from experimental data obtained in continuous fermentations. The model also accounted for physical constraints, such as the maximal oxygen transfer capacity, to ensure technical feasibility. Validation against experimental data showed good overall agreement, though oxygen demand was slightly underestimated during the production phase. Implementing a linear feed process extension further improved both STY and product concentration while maintaining oxygen transfer at its maximum capacity. Additionally, this research addressed an overlooked aspect of K. phaffii fermentation processes: the presence of an exopolysaccharide (EPS) impurity in the supernatant. Linked to a mutation in the HOC1 gene, this impurity was found to correlate with biomass formation and was independent of substrate or protein production. Finally, the study explored the impact of glucose feeding strategies on overflow metabolite formation, particularly ethanol, in K. phaffii fermentations. High glucose concentrations caused substantial ethanol accumulation, reducing biomass yield and product formation. By optimizing glucose concentrations and feeding strategies, overflow metabolites were significantly reduced, improving both biomass yield and product concentration.
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT031175394
Interne Identnummern
RWTH-2025-05775
Datensatz-ID: 1013898
Beteiligte Länder
Germany
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