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Surface plasmon resonance microscopy for the characterization of cell-substrate distances
2025
Dissertation, RWTH Aachen University, 2025
Druckausgabe: 2025. - Onlineausgabe: 2025. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
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Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-05-12
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-06060
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1014396/files/1014396.pdf
Einrichtungen
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 530
Kurzfassung
Zell-Substrat-Abstände spielen eine wichtige Rolle in vielen biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Krebstherapien, Arzneimittelentwicklung, Implantaten, und neurowissenschaftlicher Grundlagenforschung. Für die Messung des Zell-Substrat- Abstandes haben sich bereits einige Mikroskopieverfahren etabliert, darunter die Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Mikroskopie (SPRM). (Amplituden-Raster) SPRM, wie andere führende Methoden, erlaubt eine nanometerpräzise, lateral beugungs- begrenzte Abbildung des Zell-Substrat Abstands. Darüber hinaus bietet sie dies nicht-invasiv und markerfrei. Zusätzlich zu Zell-Substrat-Abständen liefert die verwendete SPRM-Variante gleichzeitig den zytoplasmatischen Brechungsindex. Dies ist nicht nur eine interessante Ergänzung, sondern auch eine Notwendigkeit für die Genauigkeit dieser Art von Messung. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, durch die Entwicklung einer automatisierten und robusten Datenanalyse SPRM zugänglicher und reproduzierbarer zu machen. Bisher bestehende Hürden für Anwendende sowie Anforderungen an Proben und Messdaten sollen gesenkt werden. Ein damit verbundenes Ziel ist die Bestimmung der resultierenden Messunsicherheiten, die Demonstration des erreichbaren Anteils auswertbarer Messungen sowie die Diskussion der Messergebnisse im Methodenvergleich. Neben der primären Durchführung von Messungen an einem SPRM-Prototypen werden Röntgenreflektometrie (XRR), Lichtmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie als sekundäre Methoden ergänzend hinzugezogen. Insbesondere XRR bietet hier ein bisher ungenutztes Potential zur Charakterisierung von SPRM-Sensoren. Die Ergebnisse dieser Arbeit umfassen die Entwicklung und Veröffentlichung einer neu- en Datenanalyse-Software sowie die erfolgreiche Durchführung und Auswertung einer Kugel-Substrat-Abstandsmessung zur Validierung des Aufbaus und der Datenanalyse. Letztere ermöglicht erstmals die experimentelle Bestimmung von statistischen und systematischen Messfehlern, jeweils aufgerundet zu ±5.8 nm (stat) −5.2 nm (syst) auf Au-Substraten und ±8.9 nm (stat) +6.3 nm (syst) auf SiO2 -Substraten. Folgend wird ein Datensatz von 68 SPRM-Messungen von HEK293-Zell-Substrat-Abständen auf SiO2 -beschichteten Substraten präsentiert, wobei sechs gängige biochemische Zelladhäsionsbeschichtungen mit unbehandelten SiO2 -Oberflächen verglichen werden. Die Sensorcharakterisierungen mittels SPRM und XRR stimmen im Rahmen der Messunsicherheiten überein. Die ausgewerteten Zell-Substrat-Abstände werden mit elektronenmikroskopisch (TEM) gemessenen, bereits publizierten Werten verglichen. Am auffälligsten ist hier, dass SPRM-gemessene Zell-Substrat-Abstände unter 50 nm selten (8.9 %) sind im Gegensatz zu TEM-Messergebnissen (44.5 %). Eine weitere Messreihe von 25 Neuronen-Substrat Abstandsmessungen auf reinen Au-Substraten, mit oder ohne einer von zwei gängigen Zelladhäsionsbeschichtungen wird ebenfalls vorgestellt. Insbesondere für jene, die mit den Herausforderungen der Amplituden- Raster-SPRM vertraut sind, sei betont, dass die vorgestellten Messreihen vollständig ausgewertet werden konnten.Cell-substrate distances play an important role in many biomedical applications, including cancer therapies, drug development, implants, and fundamental neuro- science research. Several microscopic approaches have been established to measure cell-substrate distances, including surface plasmon resonance microscopy (SPRM). (Amplitude-scanning) SPRM, like other leading methods, provides nanometer-precise imaging of the cell-substrate distance with diffraction-limited lateral resolution. Al- so, it has the advantage of being both non-invasive and label-free. In addition to cell-substrate distances, the employed variant of SPRM provides simultaneously the cytoplasmic RI, which can be seen as a complement and a necessity. One goal of this work is to make SPRM more accessible and reproducible through the development of an automated and robust data analysis, thereby reducing exi- sting barriers for users and requirements for sample and measurement data. Related objectives are to determine the resulting measurement uncertainties, demonstrate the achievable, analyzable fraction of measurements, and to discuss measurement results in a method comparison. In addition to primary measurements on an SPRM prototype, X-ray reflectometry (XRR), optical microscopy and atomic force microscopy (AFM) are used as secondary methods for verification and substrate-quality assessment. In particular, XRR offers untapped potential for the characterization of SPRM sensors. The results of this work include the development and publication of a new data ana- lysis software and the successful implementation and evaluation of a sphere-substrate distance measurement to validate the setup and data analysis. The latter allows the experimental determination of statistical and systematic measurement errors, rounded up to ±5.8 nm (stat) −5.2 nm (syst) on Au substrates and ±8.9 nm (stat) +6.3 nm (syst) on SiO2 substrates. A data set of 68 SPRM measurements of HEK293 cell-substrate distances on SiO2-coated substrates is then presented, comparing six common biochemical cell adhesion coatings with untreated SiO2 surfaces. SPRM and XRR sensor characterizations are in agreement within measurement uncertainties. Analyzed cell-substrate distances are compared with previously published values measured by electron microscopy (TEM). It is noticeable that SPRM cell-substrate distances below 50 nm are rather rare (8.9 %) in contrast to TEM measurements (44.5 %). Another series of 25 neuron-substrate distance measurements on bare Au substrates, with or without one of two common cell adhesion coatings, is also presented. For those who are familiar with the challenges of amplitude-scanning SPRM, it should be emphasized that the presented series of cell-substrate distance measurements could be fully evaluated.
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis/Book
Format
online, print
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT031191344
Interne Identnummern
RWTH-2025-06060
Datensatz-ID: 1014396
Beteiligte Länder
Germany
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