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001015345 245__ $$aStructuring spatiotemporal oxygen environments for microbial single-cell analysis in microfluidics$$cvorgelegt von Keitaro Kasahara$$honline
001015345 246_3 $$aStrukturierung räumlich-zeitlicher Sauerstoffumgebungen in der mikrofluidischen Einzelzellanalyse von Mikroorganismen$$yGerman
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001015345 3367_ $$0PUB:(DE-HGF)11$$2PUB:(DE-HGF)$$aDissertation / PhD Thesis$$bphd$$mphd
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001015345 502__ $$aDissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2025$$bDissertation$$cRheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen$$d2025$$gFak04$$o2025-06-06
001015345 5203_ $$aDie Einzelzellanalyse lebender Mikroorganismen in mikrofluidischen Versuchsanordnungen ist eine innovative experimentelle Methode zur Aufschlüsselung des mikrobiellen Wachstums mit Einzelzell-Auflösung. Die Mikrofluidik ermöglicht dabei die Kultivierung der Organismen unter genau kontrollierten Bedingungen. Bisher gibtes kaum veröffentliche Studien und technische Ansätze, in denen eine praktikable, räumlich-zeitliche O2-Kontrolle im Mikrochip realisiert wurde. Dabei gehört Sauerstoff zu den Faktoren, die einen erheblichen Einfluss auf das mikrobielle Wachstum haben. In dieser Dissertation werden verschiedene Systeme zur Steuerung des im Chip vorhandenen Sauerstoffs entwickelt und experimentell charakterisiert. Diese neuen Methoden ermöglichen das Anlegen zeitlich veränderlicher O2-Konzentrationen mit Umschaltvorgängen im Bereich von Sekunden und räumlich aufgelöste Sauerstoffgradienten im μm-Bereich. Zugeschnitten auf die bereits vorhandenen mikrofluidischen Kultivierungssysteme, wurde zunächst eine universellere Inkubatorlösung entwickelt. Durch die Verwendung eines 3D-gedruckten Mini-Inkubators, der den gasdurchlässigen Mikrofluidikchip umgibt, konnte die O2-Konzentration im Mikrofluidikchip einfach, wenn auch verhältnismäßig langsam gesteuert werden. Bildgebende Fluoreszenzlebenszeit-Messungen eines O2-empfindlichen Farbstoffes wurden implementiert, welche eine räumlich-zeitlich aufgelöste Messung der O2-Verfügbarkeit in den Fluidkanälen ermöglichen. Die Lebendzellmikroskopie erzeugt während des Experiments große Bilddatensätze, und die Deep-Learning basierte Bildanalyse im Anschluss an das Experiment ermöglicht, eine effiziente und robuste Analyse.Darüber hinaus wurde ein integrativer Ansatz für einen zweilagigen mikrofluidischen Chip entwickelt, der eine erheblich schnellere O2-Kontrolle in der mikrobiellen Einzelzellanalyse ermöglicht. Der neu entwickelte mikrofluidische Chip erlaubt reproduzierbare O2-Oszillationen mit Perioden im Sekundenbereich und länger. Dieser Ansatz ermöglicht erstmalig durchgeführte, zeitlich aufgelöste Wachstumsanalysen unter schnellen Sauerstoff-Veränderungen. Diverse Fallstudien wurden durchgeführt, indem aerobes, anaerobes Wachstum und die zelluläre Adaption von E. coli und C. glutamicum untersucht wurden, welche mit herkömmlichen Kultivierungsmethoden bisher nicht möglich waren. In einer dritten Entwicklungsstufe, wurden zweischichtige mikrofluidische Chips entwickelt, die eine räumliche O2-Kontrolle, z.B. das Anlegen von Gradienten im Bereich von mm bis μm ermöglichen. Erste experimentellen Ergebnisse waren erfolgreich und zeigen die Möglichkeit der räumlichen O2-Kontrolle. Die vorgeschlagenen Konzepte sollen zukünftig für weitere Wachstumsanalysen in räumlich-zeitlich strukturierten O2-Mikroumgebungen eingesetzt werden.$$lger
001015345 520__ $$aMicrobial single-cell analysis using microfluidics is a promising method for studying microbial growth behavior in detail under precisely controlled environments. However, little effort has been made to incorporate spatiotemporal O2 control, a critical factor influencing microbial growth and physiology. This dissertation explores various strategies for establishing straightforward O2 control, temporal O2 control in the range of seconds to minutes, and spatial O2 control in the range of micrometers. First, a comprehensive experimental platform was developed that is transferable to microbial single-cell analysis within various formats of microfluidic devices. Using a low-cost 3D-printed mini-incubator surrounding the air-permeable PDMS microfluidic chip, the O2 concentration in the microfluidic chip was controlled. The O2 sensing method using FLIM and an O2-sensitive dye was also implemented, allowing direct measurement of the O2 availability inside the fluid channels. Subsequent imaging with timelapse microscopy and deep-learning-based image analysis provided a solid platform for data analysis. Furthermore, a double-layer microfluidic chip was developed to implement spatiotemporal O2 control in microbial single-cell analysis. The newly developed microfluidic platform could reproduce O2 oscillations occurring within seconds to minutes, thus enabling time-resolved microbial growth analysis at single-cell resolution. The case studies were performed by studying the aerobic and anaerobic growth and adaptation of E. coli and C. glutamicum. The growth analysis results revealed aerobic/anaerobic specific growth and growth adaptation in response to O2 oscillations, insights that cannot be obtained using conventional cultivation setups. Lastly, several different designs of the double-layer microfluidic chip were introduced to achieve spatial O2 control in microbial single-cell analysis in the range from millimeters down to micrometers. The experimental results demonstrated the capability of spatial O2 control by diffusion. The proposed concepts and devices are expected to be used for further microbial growth characterization under spatiotemporally structured O2 microenvironments.$$leng
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