Development of a $\mathrm{H_{2}}$-driven enzymatic cascade to produce $N$-heterocycles in C. necator

Castro González, Itzel Andrea; Lauterbach, Lars; Guillouet, Stéphane

doi:44798

Development of a $\mathrm{H_{2}}$-driven enzymatic cascade to produce $N$-heterocycles in C. necator

Castro González, Itzel Andrea^RWTH*

2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von M. Eng. Itzel Andrea Castro González

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2025

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2025. - Dissertation, INSA Toulouse, 2025

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University. - Cotutelle Dissertation

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Lauterbach, Lars (Thesis advisor)^RWTH* ; Guillouet, Stéphane (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-07-30

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-07862
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1018472/files/1018472.pdf

Einrichtungen

Projekte

ConCO2rde - Training network on the conversion of CO2 by smart autotrophic biorefineries (955740) (955740)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Cupriavidus necator (frei) ; N-heterocycles (frei) ; biotransformation (frei) ; enzymatic cascade (frei) ; lithoautotrophy (frei) ; oxidoreductases (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die steigenden CO2-Emissionen erfordern nachhaltige Alternativen zur Wiederverwendung dieser reichlich vorhandenen, aber unterschätzten Kohlenstoffquelle. Ein vielversprechender Ansatz ist die Verwendung von CO2 als Kohlenstoffquelle zur Erhaltung autotropher Organismen bei gleichzeitiger Biosynthese interessanter Produkte. Autotrophe Organismen nehmen CO2 auf natürliche Weise als Kohlenstoffquelle auf und nutzen Licht oder anorganische Verbindungen als Energiequelle. Autotrophe Systeme erfordern jedoch noch immer gentechnische Veränderungen, um den Anforderungen der industriellen Produktivität und Effizienz gerecht zu werden. Unter den autotrophen Mikroorganismen ist Cupriavidus necator ein fakultativer Chemolithotroph, der CO2 als einzige Kohlenstoffquelle, H2 als Energiequelle und O2 als Elektronenakzeptor nutzt. Obwohl diese metabolische Vielseitigkeit es C. necator ermöglicht, verschiedene Moleküle von kommerziellem Interesse zu produzieren, gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Nutzung seines H2-getriebene Stoffwechsels zur Gewinnung von Feinchemikalien befassen. In dieser Studie wurde ein neues Verfahren untersucht, um mithilfe einer H2-getriebenen enzymatischen Kaskade hochwertige Moleküle in C. necator zu gewinnen. Die Produktion von Stickstoffheterocyclen (N-Heterocyclen) wurde aufgrund ihrer Bedeutung für die chemische Industrie, insbesondere als Bausteine für Arzneimittel, ausgewählt. Die Arbeit baut auf früheren Arbeiten mit drei verschiedenen Oxidoreduktasen auf und erweitert diese, um eine funktionelle in vivo- lithoautotropher Enzymkaskade in C. necator zu etablieren. Die enzymatische Kaskade besteht aus heterologen Varianten der O2-abhängigen Putrescin-Oxidase (PuOx), der NADH-abhängigen Imin-Reduktase (IRED) und der nativen NAD+-abhängige Hydrogenasen (SH) aus C. necator für die Cofaktor-Recycling. C. necator wurde für die heterologe Produktion von PuOx- und IRED-Varianten entwickelt, und die Proteinproduktion wurde unter heterotrophen Bedingungen mit Minimalmedien bewertet. Zur Verbesserung der Proteinproduktion wurden mehrere Stämme getestet und enzymatische Assays durchgeführt, die bestätigten, dass IRED im löslichen Extrakt von C. necator aktiv war. Darüber hinaus wurde die Produktion von PuOx und IRED in einzelnen C. necator-Stämmen sowohl unter heterotrophen als auch unter lithoautotrophen Bedingungen beobachtet.C. necator wurde für die heterologe Produktion von PuOx- und IRED-Varianten gentechnisch verändert, und die Proteinproduktion wurde unter heterotrophen Bedingungen evaluiert. Nachdem eine heterologe Proteinproduktion beobachtet wurde, wurde C. necator weiter gentechnisch verändert, um PuOx und IRED zu kombinieren und die enzymatische Kaskade unter lithoautotrophen Bedingungen zusammenzufügen. Parallel dazu wurde der Übergang von Heterotrophie zu Lithoautotrophie unter Verwendung von Fructose oder Glycerin im Vorkulturmedium verglichen. Eine dreistufige Kultur mit Glycerin im letzten Vorkulturmedium führte zu einem optimierten Protokoll für den Übergang zum lithoautotrophen Wachstum in C. necator. Das optimierte Kultivierungsprotokoll wurde verwendet, um die Wirkung von Putrescin, einem potenziellen Substrat für die enzymatische Kaskade Wachstums- und Zytometrieanalysen zeigten, dass Putrescin unter lithoautotrophischen Bedingungen für C. necator nicht toxisch ist. Es toleriert bis zu 100 mM Putrescin mit minimalen Auswirkungen auf die spezifische Wachstumsrate, verursacht jedoch eine verlängerte Lag-Phase und verändert die Zellmorphologie. Das optimierte Protokoll wurde beibehalten, um die assemblierte Enzymkaskade in gentechnisch veränderten C. necator-Stämmen zu evaluieren. C. necator wurde weiterentwickelt, um PuOx und IRED zu kombinieren und die enzymatische Kaskade zusammenzufügen. Erste Experimente mit der enzymatischen Kaskade zeigten Herausforderungen in dem von PuOx katalysierten Schritt. Dennoch bestätigten weitere Analysen, dass die IRED-katalysierte Reaktion in C. necator ablief und nach 48 Stunden Biotransformation unter lithoautotrophen Bedingungen eine Umwandlung von 2-Methyl-1-pyrrolin zu 2-Methylpyrrolidin von 0,8 % erreichte. Mit Fokus auf diesen Schritt wurde die IRED-Expression optimiert und die Biotransformationsleistung unter heterotrophen und lithoautotrophen Bedingungen verglichen. Nach 24 Stunden lithoautotropher Biotransformation wurde eine Umwandlung von 67 % beobachtet mit sicheres Gasgemisch, was schneller war als unter heterotrophen Bedingungen.Diese Studie schuf die Grundlage für eine robuste Biotransformationsstrategie in C. necator und demonstrierte dessen Potenzial als nachhaltiger mikrobieller Wirt für die Produktion von N Heterocyclen. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Optimierung der Produktivität, die Verbesserung der PuOx-Expression und die Produktextraktion optimieren. Durch die Integration von Oxidoreduktasen in den H2- getriebene Stoffwechsel von C. necator unterstreicht diese Forschung das Potenzial lithoautotropher Biotransformationen und positioniert C. necator als einen wichtigen Mikroorganismus im Übergang zu einer CO2-basierten Bioökonomie.

The increasing CO2 emissions require sustainable alternatives to repurpose this abundant yet undervalued carbon source. A promising approach is using CO2 as carbon source to sustain autotrophic organisms, while performing biosynthesis of products of interest. Autotrophic organisms naturally assimilate CO2 as a carbon source while using light or inorganic compounds as energy sources. However, autotrophic systems still require genetic engineering to meet industrial productivity and efficiency demands. Among autotrophic microorganisms, Cupriavidus necator is a facultative chemolithotroph which uses CO2 as sole carbon source, H2 as energy source, and O2 as electron acceptor. Although this metabolic versatility allows C. necator to produce diverse molecules of commercial interest, few studies have focused on using its H2-driven metabolism for obtention of fine chemicals.In this study, a new process was explored to obtain high-value molecules in C. necator using a H2 driven enzymatic cascade. Production of Nitrogen heterocycles (N-heterocycles) was selected because of their relevance across the chemical industry, notably as building blocks in pharmaceuticals. The thesis builds upon previous works with three different oxidoreductases, and extends them to establish a functional in vivo enzymatic cascade in C. necator. The enzymatic cascade consists of heterologous variants of O2-dependent putrescine oxidase (PuOx), NADH-dependent imine reductase (IRED), and the native NAD+-dependent soluble hydrogenase (SH) from C. necator for cofactor recycling. C. necator was engineered for the heterologous production of PuOx and IRED variants, and protein production was evaluated under heterotrophic conditions with minimal media. Several strains were tested to improve protein production, and enzymatic assays were performed, confirming that IRED was active in the soluble extract of C. necator. Moreover, PuOx and IRED production was observed in individual C. necator strains in both heterotrophic and lithoautotrophic conditions. In parallel, the transition from heterotrophy to lithoautotrophy was compared using fructose or glycerol in the preculture medium. A three-step culture with glycerol in the last preculture medium resulted in an optimized protocol to transition to lithoautotrophic growth in C. necator. The optimized cultivation protocol was used to assess the effect of putrescine, a potential substrate for the enzymatic cascade. Growth and cytometry analyses revealed that putrescine is not toxic for C. necator in lithoautotrophic conditions, tolerating up to 100 mM putrescine with minimal impact in specific growth rate, but causing an extended lag phase and changing cell’s morphology. The optimized protocol was retained to evaluate the assembled enzymatic cascade in C. necator engineered strains. C. necator was further engineered to combine PuOx and IRED, and assemble the enzymatic cascade. Initial experiments with the enzymatic cascade revealed challenges in the step catalyzed by PuOx. Nonetheless, further analysis confirmed that the IRED-catalyzed reaction proceeded within C. necator, reaching 0.8 % conversion from 2-methyl-1 pyrroline to 2-methylpyrrolidine after 48 h of biotransformation under lithoautrophic conditions. Focusing on this step, IRED expression was optimize, and biotransformation performance was compared under both heterotrophic and lithoautotrophic conditions. An increase to 67 % conversion was observed after 24 h of lithoautotrophic biotransformation with safe-gas mixture, being faster than in heterotrophic conditions. This study established the basis for a robust biotransformation strategy in C. necator, demonstrating its potential as a sustainable microbial host for N-heterocycle production. Future work will focus on optimizing productivity, improving PuOx expression, and downstream product extraction. By integrating oxidoreductases with C. necator’s H2-driven metabolism, this research highlights the potential of lithoautotrophic biotransformations, and positions C. necator as a key microorganism in the transition towards a CO2-based bioeconomy.

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