Development of a sustainable process for the valorization of chitin from marine waste streams using the chitinolytic bacterium Photobacterium arenosum

Helbig, Carlos A.; Büchs, Jochen; Schillberg, Stefan Johannes

doi:44708

Development of a sustainable process for the valorization of chitin from marine waste streams using the chitinolytic bacterium Photobacterium arenosum

Helbig, Carlos A.^RWTH*

2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Carlos A. Helbig, M. Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2025

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2025

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schillberg, Stefan Johannes (Thesis advisor)^RWTH* ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-08-26

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-07909
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1018636/files/1018636.pdf

Einrichtungen

Projekte

BlueBio - ERA-NET Cofund on Blue Bioeconomy - Unlocking the potential of aquatic bioresources (817992) (817992)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Chitin (frei) ; Chitosan (frei) ; Python (frei) ; photobacterium arenosum (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Chitin ist eine erneuerbare, jedoch wenig genutzte Ressource. Kurzkettige Chitinabbauprodukte mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 1–20 Einheiten weisen vielfältige bioaktive Eigenschaften auf, darunter entzündungshemmende und tumorhemmende Wirkungen sowie die Stimulierung der Hyaluronsäureproduktion in Eukaryotischen Zellen. Die derzeitigen Methoden zur Reinigung von Chitin erfordern jedoch giftige Chemikalien, die eine Gefahr für die Umwelt darstellen. Ziel dieser Studie war es, einen nachhaltigen Prozess zur Verwertung von ungenutztem Chitin aus marinen Quellen unter Verwendung des Meeresbakteriums Photobacterium arenosum, nachfolgend Chi5 genannt, zu entwickeln. Das Ziel dieser Studie war es, Chi5’s Fähigkeit verschiedene chitinhaltige Substrate zu verstoffwechseln, Biomasse zu erzeugen und chitinolytische Enzyme zu produzieren zu untersuchen. Ein weiteres Ziel war die Herstellung von Chitinabbauprodukten, die Bewertung der Effizienz der produzierten Enzyme und die Reinigung der enzymatischen Reaktionsprodukte mittels skalierbarer Methoden. Die vorgestellte Studie wurde in fünf Kapitel unterteilt, die jeweils zur Entwicklung des endgültigen Verfahrens zur Herstellung kurzer Chitinabbauprodukte aus chitinhaltigen Substraten aus Abfallströmen beitrugen. In Kapitel 1 wurde das biotechnologische Potenzial des Meeresbakteriums Chi5 zur Verwertung von Chitin untersucht, indem es mit verschiedenen chitinhaltigen Substraten als Nährstoffquelle kultiviert wurde. Die Analyse der in dieser Studie vorgestellten Wachstumskurven erfolgte anhand einer Reihe von Sigmoid-Modellen, nämlich logistischen, Boltzmann- und Gompertz-Modellen, die es ermöglichten, die Wachstumskurven anhand ihrer relativen Leistung zu ordnen und die Fähigkeit von Chi5 zur Verwertung chitinhaltiger Substrate zu bewerten. Die Integrale der exponentiellen Phasen wurden berechnet und durch die Länge ihrer entsprechenden exponentiellen Phase geteilt, wodurch ein Gesamtwert für die Wachstumsleistung zur Einstufung der Kurven ermittelt wurde. Die chemische Demineralisierung von Chitinsubstraten aus chinesischen Wollhandkrabben und Nordsee Garnelen erhöhte die Wachstumsleistung signifikant von 32 % auf 67 % bzw. von 35 % auf 81 %, was darauf hindeutet, dass die enzymatische Zugänglichkeit der Substrate durch Mineralisierung verringert werden kann. Die Kultivierung mit Königskrabbensubstrat erreichte jedoch eine relative Leistung von 44 % im Vergleich zur Kultivierung mit gereinigtem Chitin, was die Fähigkeit von Chi5 zeigt, Rohsubstrate für die Produktion von Biomasse und Enzymen effizient zu nutzen. Die vorgestellte Methodik unterstrich die Eignung der Modelle für die Bewertung des Kulturwachstums auf der Grundlage verschiedener Substrate und hob ihre potenziellen Anwendungen in der Biotechnologie hervor. In Kapitel 2 wurde der enzymatische Chitinabbau als umweltfreundliche Alternative zu chemischen Verfahren unter Verwendung der aus Kulturüberständen isolierten Enzymmischung von Chi5 untersucht. Die Verwendung verschiedener chitinhaltiger Substrate als Nährstoffquellen für die Kultivierung beeinflusste die Enzymsekretion, was zu Veränderungen in der Menge und Konzentration der chitinolytischen Enzyme führte. Chi5-Kultivierungen mit gereinigtem Chitin in komplexem und minimalem Medium zeigten aufgrund einer höheren Nährstoffmenge eine 1,8-fach höhere Biomasseproduktion im komplexen Medium, aber die isolierte Enzymmischung lieferte nur 125 µM reduzierende Zucker im Vergleich zu 500 µM, die mit der aus Kultivierungen in minimalem Medium isolierten Enzymmischung erzielt wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sekretion von chitinolytischen Enzymen stark reguliert ist und nur induziert wird, wenn die Zellen auf die Enzyme angewiesen sind. Darüber hinaus ergab ein Vergleich der enzymatischen Aktivität des Enzymmischung und einer rekombinanten Chitinase aus Chi5, dass die Enzymmischung in derselben Zeit eine 2,2-fach höhere Ausbeute an reduzierendem Zucker erzielte als die gleiche Masse an rekombinanter Chitinase, was auf synergistische Wechselwirkungen zwischen den Enzymen in der Mischung hindeutet. Allerdings zeigte die Mischung nach drei Stunden Inkubation bei einer Konzentration von 1,5 mM reduzierenden Zuckern auch eine Produktinhibierung, wodurch ihre Fähigkeit zur Produktion von Chitinabbauprodukten eingeschränkt wurde. Insgesamt zeigte die Enzymmischung von Chi5 eine viermal schnellere Aktivität als rekombinante Chitinasen und chitinolytische Enzymmischungen aus anderen Organismen, über die in der Literatur berichtet wird, erzielte jedoch dreimal geringere Ausbeuten als etablierte chemische Chitinabbauverfahren. In Kapitel 3 wurden Chitinabbauprodukte mittels Massenspektrometrie analysiert, wobei sich zeigte, dass das Chitinpolymer in Monomere und Dimere mit unterschiedlichen Acetylierungsmustern zerlegt wurde, was darauf hindeutet, dass die chitinolytische Enzymmischung hauptsächlich Exo-Chitinasen und Deacetylasen enthält. Die Transglykosylierungsaktivität (TG) von zwei rekombinanten Chitinasen wurde untersucht, mit dem Ziel, diese Monomere und Dimere zu längeren Oligomeren wieder zusammenzusetzen. Wildtyp-Enzyme (WT) zeigten jedoch hydrolytische Aktivität, aber keine TG-Aktivität, sodass dieser Ansatz für die effiziente Herstellung von Chitin- und Chitosan-Oligomeren ungeeignet ist. Es sind weitere Forschungen auf diesem Gebiet erforderlich, um besser zu verstehen, wie diese Enzyme wirken, bevor dieser Ansatz eine Alternative zu chemischen Abbaumethoden darstellen kann. Kapitel 4 beschrieb die erfolgreiche Skalierung der Chi5-Kultivierungen und den enzymatischen Chitinabbau in vitro. Die Batch-Kultivierungen wurden von 1 ml im BioLector I auf 500 ml im DASGIP-Rührkessel-Bioreaktorsystem unter Verwendung von Königskrabbensubstrat skaliert. Chi5 metabolisierte bis zu 90,5 % des Substrats und produzierte bis zu 0,8 g Zellfeuchtgewicht pro Gramm verdautem Chitin. Unter Verwendung von 20 g/l Königskrabben-Substrat wurde das Kultivierungswachstum über 50 Stunden Inkubation aufrechterhalten. Um die Kultivierungszeit weiter zu verlängern und den Bioreaktor vor potenziell abrasiven unlöslichen Partikeln zu schützen, wurde eine Bypass-Chitin-Kartusche angeschlossen. Dadurch konnte Chi5 mindestens 95 Stunden lang kultiviert werden. Die Verstopfung der Chitinpatrone führte jedoch schließlich zu einem erzwungenen Stopp der Kultivierung, könnte aber durch eine Vergrößerung des Schlauchdurchmessers und der Partikelgröße des Substrats in der Chitinpatrone behoben werden. Die Implementierung der Chitinpatrone in ein TFF-System ermöglichte den kontinuierlichen enzymatischen Abbau des Königskrabben-Substrats und die gleichzeitige Sammlung der Chitinabbauprodukte unter Verwendung eines Hohlfasermoduls. Das Modul hielt die Enzyme im System zurück, sodass Chitinabbauprodukte gesammelt werden konnten und die Produkthemmung der Enzymmischung überwunden wurde. Die Chitinpatrone führte jedoch zu einem Druckaufbau im System und einer niedrigen Produktkonzentration von 1,5 µg/L. Weitere Anpassungen, z. B. eine erhöhte Enzymkonzentration und eine andere Partikelgröße des Substrats, könnten die Produktausbeute steigern und diesen Prozess zu einer rentablen Alternative zu chemischen Verfahren machen. Kapitel 5 zeigte, dass Chitosan-Standards erfolgreich durch Ionenaustauschchromatographie (IEX) fraktioniert wurden. Eine enzymatisch verdaute Probe, die Chitin und Chitosan-Abbauprodukte enthielt, band jedoch unter denselben Bedingungen nicht an die Säule. Verunreinigungen wie Mineralien, Pigmente, Peptide und Fettsäuren, die aus Krabbenschalen freigesetzt wurden, könnten die Bindung an die Säule gehemmt haben. Die langsame Deacetylierung von Chitosan durch Deacetylasen im Enzymmischung könnte ebenfalls ein Faktor sein. Die Studie betonte die Notwendigkeit von Anpassungen der Puffer- und Enzymmischungszusammensetzung, um die Reinigung von Chitinabbauprodukten zu erleichtern. Diese Studie präsentiert die erfolgreiche Entwicklung eines Verfahrens zur Verwertung von ungenutzten chitinhaltigen Substraten. Obwohl seine Effizienz noch nicht den Standards für kommerzielle Anwendungen entspricht, ergänzt jedes Kapitel die verschiedenen Aspekte des Projekts und umfasst die Bereiche Mikrobiologie, Biotechnologie und Datenwissenschaft.

Chitin is an abundant and renewable yet underutilized resource. Short chitin-degradation products with a degree of polymerization (DP) of 1-20 exhibit diverse bioactive properties, such as anti-inflammatory and anti-tumor activity, as well as the stimulation of hyaluronic acid production. However, current chitin purification methods require toxic chemicals, posing an environmental hazard. This study aimed to develop a sustainable process for the valorization of underutilized chitin from marine sources using the marine bacterium Photobacterium arenosum called Chi5. The research aimed to evaluate Chi5's capability to metabolize various chitinous substrates, generate biomass, and produce chitinolytic enzymes. It further aimed to produce chitin-degradation products, evaluate the efficiency of the produced enzymes, and to purify the enzymatic reaction products using scalable methods. The study was divided into five chapters, each contributing to the development of the final process to produce short chitin-degradation products from chitinous substrates obtained from waste streams. Chapter 1 explored the biotechnological potential of the marine bacterium Chi5 to metabolize chitin by cultivating it with different chitinous substrates as nutrient source. The analysis of growth curves presented in this study employed a series of sigmoid models, i.e., logistic, Boltzmann, and Gompertz models, allowing to rank the growth curves based on relative performance and evaluate Chi5’s ability to valorize chitinous substrates. The integrals of the exponential phases were computed and divided by the length of their corresponding exponential phase providing an overall growth performance score value to rank the curves. Chemical de-mineralization of chitinous substrates from Chinese mitten crab and brown shrimp significantly increased growth performance from 32% to 67% and from 35% to 81%, respectively suggesting, the enzymatic digestibility of substrates may be lowered by mineralization. However, cultivations with king crab substrate achieved 44% relative performance compared to cultivations using purified chitin showing, Chi5’s ability to efficiently utilize crude substrates for the production of biomass and enzymes. The presented methodology highlighted the suitability of the models for evaluating culture growth based on different substrates, emphasizing their potential applications in biotechnology. Chapter 2 explored enzymatic chitin degradation as an environmentally friendly alternative to chemical methods using Chi5’s secreted enzyme mix isolated form culture supernatants. The use of different chitinous substrates for cultivation as nutrient sources affected the enzyme secretion, resulting in alterations in the amount and concentration of chitinolytic enzymes. Chi5 cultivations with purified chitin in complex and minimal medium revealed a 1.8-fold higher bio-mass production in complex medium due to a higher amount of nutrients, but the isolated enzyme mix yielded only 125 µM reducing sugars compared to 500 µM achieved with the enzyme mix isolated from cultivations in minimal medium. These results suggest, the secretion of chitinolytic enzymes is highly regulated and only induced, if the cells rely on the enzymes. Furthermore, a comparison of the enzymatic activity of the enzyme mix and a recombinant chitinase from Chi5 revealed, the enzyme mix produced a 2.2-fold higher yield of reducing sugar than the same mass of recombinant chitinase in the same time suggesting synergistic interactions between enzymes in the mix. However, the mix also showed product inhibition at a concentration of 1.5 mM reducing sugars after three hours of incubation, limiting its ability to produce chitin-degradation products. Overall, Chi5’s enzyme mix showed a 4-times faster activity than recombinant chitinases and chitinolytic enzyme mixes from other organisms report-ed in literature, but achieved 3-times lower yields than established chemical chitin-degradation methods. In Chapter 3, chitin-degradation products were analyzed via mass spectrometry revealing, the chitin polymer was digested into monomers and dimers with different acetylation patterns, suggesting the chitinolytic enzyme mix contains mainly exo-chitinases and deacetylases. The transglycosylation (TG) activity of two recombinant chitinases was investigated, aiming to re-assemble these monomers and dimers into longer oligomers. However, wildtype (WT) enzymes showed hydrolytic activity but no TG activity was detected, rendering this approach unsuitable for the efficient production of chitin and chitosan oligomers. More research in this field is required to better understand how these enzymes operate before this approach can become an alternative to chemical degradation methods. Chapter 4 outlined the successful scale up of Chi5 cultivations and in vitro enzymatic chitin degradation. Batch cultivations were scaled from 1 ml in the BioLector I to 500 ml in the DASGIP stirred-tank bioreactor system using king crab substrate. Chi5 metabolized up to 90.5% of the substrate producing up to 0.8 g cell wet weight per gram digested chitin. Using 20 g/L king crab substrate, cultivation growth was maintained for over 50 h of incubation. To further elongate the cultivation time and protect the bioreactor from potentially abrasive insoluble particles, a by-pass chitin cartridge was connected. This allowed to cultivate Chi5 for at least 95 h. However, blockage of the chitin cartridge eventually led to a forced stop of the cultivation but might be fixed by increasing the tubing diameter and the particle size of the substrate in the chitin cartridge. The implementation of the chitin cartridge into a TFF system al-lowed for continuous enzymatic degradation of king crab substrate and simultaneous collection of chitin-degradation products using a hollow fiber module. The module retained the enzymes in the system allowing to collect chitin-degradation products, overcoming product inhibition of the enzyme mix. However, the chitin cartridge led to pressure built up in the system and a low product concentration of 1.5 µg/L. Further adjustments e.g., increased enzyme concentration and different particle size of the substrate might increase product yields rendering this process a viable alternative to chemical processes. Chapter 5 showed that chitosan standards were successfully fractionated by ion exchange chromatography (IEX). However, an enzymatically digested sample containing chitin and chitosan degradation products did not bind to the column under the same conditions. Impurities such as minerals, pigments, peptides, and fatty acids released from crab shells might have inhibited the binding to the column. The slow deacetylation of chitosan by deacetylases in the enzyme mix could also be a contributing factor. The study emphasized the need for adjustments to the buffer and enzyme mix composition to facilitate the purification of chitin-degradation products. This study presents the successful development of a process for the valorization of underutilized chitinous substrates. Although its efficiency does not meet the standards for commercial applications yet, each chapter complements the different aspects of the project, incorporating the areas of microbiology, biotechnology, and data science.

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