First-time application of droplet digital PCR for methylation testing of the 11p15.5 imprinting regions

Schlaich, Elia; Eggermann, Thomas; Dahl, Edgar

doi:HT031354477

First-time application of droplet digital PCR for methylation testing of the 11p15.5 imprinting regions = Erstmalige Anwendung der digitalen Tropfen-PCR zur Methylierungsanalyse der 11p15.5-Prägungsregionen

Schlaich, Elia^RWTH*

2025 & 2026

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Elia Schlaich

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2025

Umfang1 Online-Ressource : Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2025

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2026

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Eggermann, Thomas (Thesis advisor)^RWTH* ; Dahl, Edgar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-06-12

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-08145
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1019096/files/1019096.pdf
URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mgg3.2264

Einrichtungen

Institut und Lehrstuhl für Humangenetik und Genommedizin (924610)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Imprintingerkrankungen (frei) ; MS-MLPA (frei) ; MS-ddPCR (frei) ; MS-pyrosequencing (frei) ; Mosaik (frei) ; imprinting disorders (frei) ; mosaicism (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das Beckwith-Wiedemann-Syndrom und das Silver-Russell-Syndrom gehören zur Gruppe der angeborenen Prägungsstörungen, die durch eine veränderte Regulation geprägter Gene gekennzeichnet sind. Diese Gene werden monoallel exprimiert, je nachdem, ob sie von der Mutter oder vom Vater vererbt werden. Durch Mutationen oder Prägungsdefekte (z.B. Epimutationen (Methylierungsstörungen)) werden diese Gene entweder biallel oder mit beeinträchtigter Funktion bzw. nicht mehr exprimiert, was zu einer veränderten Gendosis führt. Beim Beckwith-Wiedemann-Syndrom und beim Silver-Russell-Syndrom liegen gegensätzliche Veränderungen in sogenannten differentiell methylierten Regionen auf dem Chromosom 11p15.5 vor. Die häufigsten Veränderungen beim Beckwith-Wiedemann-Syndrom sind Epimutationen, insbesondere Methylierungsverlust im mütterlichen Prägungszentrum 2 (IC2) und verstärkte Methylierung im mütterlichen Prägungszentrum 1 (IC1), väterliche uniparentale Disomie von 11p15.5 und Mutationen im CDKN1C-Gen. Beim Silver-Russell-Syndrom liegt meist ein Methylierungsverlust im väterlichen IC1 oder eine mütterliche uniparentale Disomie von Chromosom 7 vor. Aufgrund der molekularen Heterogenität und des mosaikartigen Auftretens der häufigsten Veränderungen stellt die molekulare Diagnostik dieser Prägungsstörungen mit den derzeit verfügbaren diagnostischen Tests eine Herausforderung dar. Da die Bestimmung des genauen (Epi-)Genotyps von Patienten als Grundlage für eine personalisierte Therapie wichtig ist, sind neben der Analyse verschiedener Gewebe auch verschiedene Ansätze notwendig, um die Sensitivität diagnostischer Tests für Imprinting-Störungen zu erhöhen. Wir etablierten methylierungsspezifische digitale Tropfen-PCR-Tests (MS-ddPCR) für die beiden Prägungszentren IC1 und IC2 in 11p15.5 an gesunden Probanden und analysierten Patienten mit väterlicher uniparentaler Disomie des Chromosoms 11p15.5 (upd(11)pat), verstärkter Methylierung in IC1, Methylierungsverlust in IC2 und Methylierungsverlust in IC1. Wir verglichen die Ergebnisse der MS-ddPCR mit der methylierungsspezifischen (MS) MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) und der MS-Pyrosequenzierung, indem wir mit jeder Methode den Methylierungsgrad für dieselben zwei CpGs in IC1 und IC2 bestimmten. Es zeigte sich, dass unser MS-ddPCR-Test sowohl die gesunden Probanden als auch die molekularen Veränderungen bei allen Patienten identifizierte und die Ergebnisse gut mit denen der MS-MLPA übereinstimmten. Die Ergebnisse der MS-Pyrosequenzierung schwankten zwischen verschiedenen Durchläufen, während die Ergebnisse der MS-ddPCR reproduzierbar waren. MS-MLPA ist derzeit der am weitesten verbreitete Test zur Diagnose von Prägungsstörungen und ermöglicht die Untersuchung mehrerer CpGs in einem Ansatz. Allerdings ist die Sensitivität für den Nachweis niedriggradiger Mosaike umstritten. Die MS-ddPCR untersucht nur ein CpG, ist aber durch individuell wählbare Primer und Sonden sehr flexibel in der Anwendung und reduziert durch die absolute Quantifizierung der Methylierung PCR-bedingte Verzerrungen. Mit dieser Studie zeigen wir zum ersten Mal, dass die MS-ddPCR eine zuverlässige und einfach anzuwendende Methode ist, um methylierungs-assoziierte Veränderungen bei Prägungsstörungen zu identifizieren. Sie stellt damit ein zusätzliches Werkzeug für die Multimethoden-Diagnostik von Prägungsstörungen dar, das zur Verbesserung der diagnostischen Ausbeute geeignet ist.

Beckwith-Wiedemann syndrome and Silver-Russell syndrome belong to the group of congenital imprinting disorders characterised by abnormal regulation of imprinted genes. These genes are expressed monoallelically, depending on whether they are inherited from the mother or father. Mutations or imprinting defects, such as epimutations (methylation disorders), cause these genes to be expressed either biallelically, with impaired function, or not at all, thereby altering gene dosage. In Beckwith-Wiedemann syndrome and Silver-Russell syndrome, opposite changes occur in so-called differentially methylated regions on chromosome 11p15.5. The most common changes in Beckwith-Wiedemann syndrome are epimutations, especially loss of methylation in maternal imprinting centre 2 (IC2) and gain of methylation in maternal imprinting centre 1 (IC1), paternal uniparental disomy of 11p15.5 and mutations in the CDKN1C gene. In Silver-Russell syndrome, there is usually a loss of methylation in paternal IC1 or a maternal uniparental disomy of chromosome 7. The molecular diagnosis of these imprinting disorders is challenging with currently available diagnostic tests due to the molecular heterogeneity and mosaic-like occurrence of the most common changes. Since the determination of the exact (epi)genotype of patients is important as a basis for personalised therapy, several approaches are needed to increase the sensitivity of diagnostic tests for imprinting disorders, besides the analysis of DNA from different tissues. We established methylation-specific digital droplet PCR (MS-ddPCR) assays for the two imprinting centres IC1 and IC2 at 11p15.5 in healthy individuals and analysed patients with paternal uniparental disomy of chromosome 11p15.5 (upd(11)pat), increased methylation in IC1, loss of methylation in IC2 and loss of methylation in IC1. We compared the results of MS-ddPCR with methylation-specific (MS) MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) and MS-pyrosequencing by determining the degree of methylation for the same two CpGs in IC1 and IC2 with each method. It was found that our MS-ddPCR test identified the molecular alterations in both the healthy subjects and all the patients, and the results matched well with those of the MS-MLPA. MS-pyrosequencing results varied between runs, whereas MS-ddPCR results were reproducible. MS-MLPA is currently the most widely used test for the diagnosis of imprinting disorders and allows the study of multiple CpGs in one approach. However, its sensitivity for detecting low-grade mosaics has been questioned. MS-ddPCR analyses only one CpG, but is very flexible due to individually selectable primers and probes and reduces PCR-induced bias by absolute quantification of methylation. With this study, we show for the first time that MS-ddPCR is a reliable and easy-to-use method for identifying methylation associated changes in imprinting disorders. It thus represents an additional tool for the multimethod diagnosis of imprinting disorders, which is suitable for improving the diagnostic yield.

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