Untersuchungen zum ASIC-abhängigen säureinduzierten Zelltod

Richter, Anton; Gründer, Stefan; Huber, Michael

doi:10.18154/RWTH-2025-10125

Untersuchungen zum ASIC-abhängigen säureinduzierten Zelltod = Studies on ASIC-dependent acid-induced cell death

Richter, Anton^RWTH*

2025 & 2026

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anton Richter

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2025

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2025

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2026

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Gründer, Stefan (Thesis advisor)^RWTH* ; Huber, Michael (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-11-13

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-10125
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1022616/files/1022616.pdf

Einrichtungen

Institut und Lehrstuhl für Physiologie (512000-2 ; 921410)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
2015 wurde durch die Gruppe Wang et al. eine säureinduzierte, ASIC1a-abhängige Aktivierung des Zelltodmechanismus Nekroptose postuliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum einen, mittels LDH-Zytotoxizitätsassays zu untersuchen, ob auch der Heteromer ASIC1a:ASIC2a säureinduzierte Nekroptose auslösen kann und ob diese pharmakologisch inhibierbar wäre. Zum anderen sollte mittels Western-Blot die Aktivierung bzw. Phosphorylierung der Nekroptosekaskadenbestandteile RIPK1 und RIPK3 auf eine mögliche ASIC1a-Abhängigkeit hin untersucht werden. Dies zielte auch auf etwaige zeitliche Unterschiede in der Phosphorylierung (0,5, 1, 3 und 6 h) sowie auf die pharmakologische Inhibierbarkeit ab. Für die Experimente wurden verschiedene HeLa-Zellreihen, wie HeLa-Wildtyp und RIKP3-exprimierende HeLa-Zellen verwendet.Im Rahmen dieser Arbeit konnte keine durch den Heteromer ASIC1a:ASIC2a säure-induzierte Nekroptose und auch keine pharmakologische Inhibierbarkeit nachgewiesen werden. Mit dem Homomer ASIC1a blieb bei saurem pH-Wert ebenso der Nachweis von Nekroptose sowie der protektiven Inhibitorenwirkung von Nec1s und PcTx1, anders als bei Wang et al, aus. In Folgeexperimenten modifizierten wir das Versuchsdesign z.B. durch Verlängerung der Inkubationszeit mit saurem Medium bzw. der Proliferationszeit nach Transfektion von ASIC1a-Plasmiden sowie der Wahl eines humanen ASIC1a-Plasmids zusätzlich zu einem Ratten-Plasmid. Die dabei beobachteten Effekte wie z.B. Apoptose wurden als vermutlich unspezifisch bewertet. In den Western-Blots zeigten sich innerhalb des 6-stündigen Zeitfensters keine ASIC1a-abhängigen, säureinduzierten Phosphorylierungen der RIPK1 oder RIPK3. Somit wurden auch keine zeitlichen Unterschiede oder inhibitorischen Effekte pharmakologischer Substanzen wie Nec1s festgestellt. Fazit ist, dass in unserem Setting kein Nachweis von Nekroptose durch den ASIC1a:ASIC2a Heteromer oder ASIC1a Homomer sowie keine Phosphorylierungen der RIP-Kinasen 1 und 3 festgestellt werden konnten. Bei einer Vielzahl der Beobachtungen handelte es sich um unspezifische Effekte. Mögliche Gründe dafür konnten wir facettenreich diskutieren und diverse Vorschläge zur Protokolloptimierung erörtern, um weiter in Richtung der vielversprechenden säureaktivierten ASIC-abhängigen Nekroptose zu forschen.

In 2015, the Wang et al. group postulated an acid-induced, ASIC1a-dependent activation of the cell death mechanism necroptosis. The aim of this study was to investigate whether the ASIC1a:ASIC2a heteromer can also trigger acid-induced necroptosis using LDH cytotoxicity assays and whether this can be inhibited pharmacologically. Secondly, the activation and phosphorylation of the necroptosis cascade components RIPK1 and RIPK3 were to be examined for a possible ASIC1a dependency using Western blotting. This also involved possible temporal differences in phosphorylation (0.5, 1, 3 and 6 h) as well as pharmacological inhibitability. Different HeLa cell lines, such as HeLa wild type and RIKP3-expressing HeLa cells, were used for the experiments. Neither acid-induced necroptosis nor pharmacological inhibition could be detected with the heteromer ASIC1a:ASIC2a. In contrast to Wang et al., the ASIC1a homomer also failed to demonstrate necroptosis and protective inhibitory effects of Nec1s and PcTx1 at acidic pH. In subsequent experiments, we modified the experimental design, e.g. by extending the incubation time with acidic medium or the proliferation time after transfection of ASIC1a plasmids and by choosing a human ASIC1a plasmid in addition to a rat plasmid. The observed effects, such as apoptosis, were evaluated as probably non-specific. Western blots showed no ASIC1a-dependent, acid-induced phosphorylation of RIPK1 or RIPK3 within the 6-hour time window. Thus, neither temporal differences nor inhibitory effects of pharmacological substances such as Nec1s were detected. In summary, no evidence of necroptosis by the ASIC1a:ASIC2a heteromer or ASIC1a homomer and no phosphorylation of RIP kinases 1 and 3 could be detected in our setting. Many the observations were non-specific effects. We were able to discuss possible reasons for this in a multifaceted manner and discuss various suggestions for protocol optimization to continue research towards the promising acid-activated ASIC-dependent necroptosis.

OpenAccess:
PDF
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