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Enzymatic processes for the multigram-scale production of nucleotide sugars
2025 & 2026
Dissertation, RWTH Aachen University, 2025
Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2026
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-10-22
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2026-01221
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1027111/files/1027111.pdf
Einrichtungen
Projekte
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Enzymkaskaden (frei) ; Glykobiotechnologie (frei) ; Nukleotidzucker (frei) ; enzyme cascades (frei) ; glycobiotechnology (frei) ; nucleotide sugars (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
Kurzfassung
Nukleotidzucker (NZ) sind sehr gefragte Produkte in Forschung und Industrie, aber nur eingeschränkt verfügbar. Diese Zucker werden klassischerweise chemisch-synthetisch, in Mikroorganismen oder enzymatisch nach dem salvage pathway hergestellt. Dieser erlaubt die stereoselektive Synthese von NZ aus einem Monosaccharid-1-P (Akzeptor) und einem Nukleotid (Donor) nach der C1-Phosphorylierung des Zuckers mittels einer Kinase. Das Ziel dieser Dissertation war die Etablierung von Enzymkaskaden für die Produktion von NZ im Multigramm-Maßstab. Hierfür wurden Enzyme des salvage pathways in Ein-Topf-Kaskaden kombiniert. Zur Produktion wurden die Enzymkaskaden nach jedem Batch durch Filtration vom Produkt getrennt und die Reaktion mit neuem Substrat wiederholt (repetitiver Batch). Die Ein-Topf-Kaskadenreaktionen wurden im Kleinstmaßstab (<600 μL) optimiert und anschließend auf den repetitiven Batch (rep.-Batch) angewendet. Mit diesem Verfahren wurden 1,6 g GDP-Fuc, 2,6 g UDP-6-azido-GalNAc und 1,4 g GDP-Man hergestellt. Die NZ-Produktion wurde an einem kontinuierlich gefütterten fed-batch-Membranreaktor weiterentwickelt. Die Enzymkaskaden wurden im Kleinstmaßstab (<600 μL) als Batchreaktionen auf die mittlere Verweilzeit des Reaktors (τ = 24-30 min) optimiert. Mittels des kontinuierlich gefütterten batch-Membranreaktors wurden 8,2 g CMP-Neu5Ac, 14,6 g UDP-GalNAc, 2,5 g UDP-Gal, 1,4 g GDP-Man und 14,8 g UDP-GlcA produziert. Das Verfahren wurde als internationales Patent veröffentlicht (WO2025132321A1). Für das Downstream-Processing wurde eine Präzipitationsmethode für NZ entwickelt, und die NZ wurden anschließend mithilfe von industriellen Kooperationspartnern aufgereinigt. Dabei wurden Orthophosphate (Pi) in 40% Isopropanol (v/v) bei 20 °C präzipitiert, während die NZ in Lösung blieben. Anschließend wurde der Isopropanolanteil auf 80% (v/v) erhöht und die NZ bei 20 °C ausgefällt. Die Präzipitation wurde auf GDP-Fuc und UDP-GlcA angewendet und zu 77% bzw. 56% aus der Rohlösung gewonnen. Abschließend wurde ein Verfahren zur Regeneration von ATP aus Saccharose und Pyrophosphat (PPi) für die Produktion von UDP-GlcNAc, GDP-Fuc und CMP-Neu5Ac entwickelt und bewertet. Das Verfahren zur ATP-Regeneration wurde international zum Patent angemeldet (WO2021219463A1).Nucleotide sugars (NS) are highly requested products in research and industry but only of limited availability. Those sugars are mainly produced by chemical synthesis or in microorganisms. However, enzymatic synthesis by salvage pathway is an alternative. It allows the stereoselective synthesis of NS from a monosaccharide-1-P (Acceptor) and a nucleotide (Donor) after the C1 phosphorylation of a sugar by a kinase. The aim of this thesis was the establishment of enzyme cascades to produce NS in the multigram-scale. For that, enzymes from the salvage pathway were combined in one-pot cascades. For production, enzyme cascades were separated from the product by filtration and fed with new substrate to repeat the production (repetitive batch). The one-pot cascade reactions were optimized in a small scale (<600 μL) and applied to the repetitive batch (rep.-batch). By this procedure, 1.6 g GDP-Fuc, 2.6 g UDP-6-azido-GalNAc and 1.4 g GDP-Man were produced. The production of NS was further developed in a continuous fed-batch membrane reactor. Here, the enzyme cascades were optimized in small-scale batch reactions (<600 μL) to match the average residence time of the reactor (τ=24-30 min). By the continuous fed-batch membrane reactor, 8.2 g CMP-Neu5Ac, 14.6 g UDP-GalNAc, 2.5 g UDP-Gal, 1.4 g GDP-Man und 14.8 g UDP-GlcA were produced. This process was further successfully filed as an international patent (WO2025132321A1). For downstream processing of NS a precipitation method was established and the NS subsequently by the industrial cooperation partners. For that, orthophosphates (Pi) were precipitated in 40 % (v/v) isopropanol at -20 °C, while the NS remain in solution. Afterward, the content of isopropanol is increased to 80% (v/v) to precipitate the NS at -20 °C. The precipitation was applied to a GDP-Fuc and UDP-GlcA raw solution and gained 77% and 56% recovery, respectively. Finally, a procedure for the regeneration of ATP was developed and evaluated, using only sucrose and pyrophosphate (PPi), and applied to the production of UDP-GlcNAc, GDP-Fuc and CMP-Neu5Ac. The method for the ATP regeneration was filed as a international patent (WO2021219463A1).
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT031394158
Interne Identnummern
RWTH-2026-01221
Datensatz-ID: 1027111
Beteiligte Länder
Germany
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