Entwicklung und Charakterisierung eines trojanischen Helicobacter pylori

Zumbusch, Tobias; Blank, Lars M.; Schillberg, Stefan Johannes

doi:HT031430983

Entwicklung und Charakterisierung eines trojanischen Helicobacter pylori = Development and characterization of a trojan Helicobacter pylori

Zumbusch, Tobias^RWTH*

2026

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Tobias Zumbusch, Master of Science

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2026

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2026

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Schillberg, Stefan Johannes (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2026-02-10

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2026-03336
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1032200/files/1032200.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Autoinducer (frei) ; Helicobacter pylori (frei) ; antimikrobielle Peptide (frei) ; genome-editing (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Humanpathogen Helicobacter pylori kolonisiert den menschlichen Magen und ist an der Entstehung von Magengeschwüren und -krebs beteiligt. Mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung ist bereits mit dem Bakterium infiziert. Der Erreger ist gut an das Milieu im Magen angepasst und in Abhängigkeit von verschiedenen individuellen Faktoren wie Mikrobiom und Immunstatus lassen sich verschiedene Krankheitsverläufe beobachten. Aktuelle Therapien erfolgen ausschließlich auf Basis von Antibiotika. Resistenzen gegenüber den verfügbaren, Therapie-relevanten Antibiotika erschweren jedoch zunehmend eine effektive Behandlung von Patienten. Daher werden langfristig alternative Therapie-Ansätze benötigt, um die Antibiotika z.B. durch antimikrobielle Peptide (AMPs) zu ergänzen bzw. zu ersetzen.Um zukünftig eine effektive Antibiotika-freie Eradizierung von H. pylori zu ermöglichen, wurde die Wirksamkeit von 13 AMPs gegenüber H. pylori untersucht. Hierbei erwiesen sich die Peptide LL-37 und Nisin A als die wirksamsten Kandidaten. Im Rahmen von Dosis-Wirksamkeitskurven wurde für beide Peptide eine mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) von ~12 µM für LL-37 und ~11 µM für Nisin A berechnet. Weiterhin wurden alle AMPs hinsichtlich ihrer zytotoxischen und hämolytischen Aktivität sowie ihrer Sensitivität gegenüber dem im menschlichen Magen vorliegenden Verdauungsenzym Pepsin analysiert. Um den Wirkstoff zum Ort der Infektion zu bringen, sollte ein modifizierter H. pylori-Stamm entwickelt werden. Dieser soll als trojanisches Pferd fungieren und sich in unmittelbarer Nähe zum Pathogen ansiedeln, um dort den Wirkstoff bei Kontakt mit pathogenen H. pylori-Zellen zielgerichtet freizusetzen. Dazu soll die Synthese und Sekretion des Wirkstoffs durch Botenstoffe, sogenannte Autoinducer (AI), angeregt werden, die vom pathogenen H. pylori freigesetzt werden. LC-MS/MS Analysen zeigten, dass H. pylori AI-2 als Botenstoff synthetisiert, nicht aber AI-1 oder AI-3. Die Attenuierung eines pathogenen H. pylori-Stamms sollte durch Deletionen von Pathogenitätsfaktoren erreicht werden. Dazu wurden drei Gen-Loci deletiert, welche für die Pathogenitätsfaktoren VacA und IceA2 sowie das Enzym LuxS codieren, das an der Katalyse eines bakteriellen Botenstoffs beteiligt ist. Eine Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestätigt das Ausbleiben der Bildung des VacA-Proteins und eine LC-MS/MS-Analytik eine signifikante Reduktion der Synthese des bakteriellen Botenstoffs AI-2. Die Bestätigung der iceA2-Deletion erfolgte mittels Sequenzierung. Vergleichende in vitro Infektionsversuche von humanen Magenschleimhautzellen erfolgten aus Zeit- und Kostengründen mit der Trojanergeneration H. pylori HP4 und zeigten wie angestrebt keine deutliche Reduktion der Kolonisierungseffizienz des Trojaners HP4 im Vergleich zum Wildtyp. Allerdings fiel auch der dabei ausgelöste Zytokin-Titer (IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ und TNF-α) ähnlich aus, was darauf hindeutet, dass die Trojanergeneration HP4 noch nicht ausreichend attenuiert ist und weiter optimiert werden muss. Daher wurde nachfolgend zusätzlich das für den Hauptpathogenitätsfaktor CagA codierende cagA-Gen deletiert und der Stamm H. pylori HP5 generiert. Ein Western-Blot Analyse bestätigte, dass der erzeugte Trojaner HP5 das CagA-Protein nicht mehr bildet. Zukünftige Studien werden klären müssen, ob hierdurch eine signifikante Reduktion der Pathogenitätparameter (IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ und TNF-α) erreicht werden kann, oder ob hierfür weitere Deletionen erfolgen müssen.

The human pathogen Helicobacter pylori is a bacterium that colonizes the human stomach and is involved in the development of stomach ulcers and cancer. More than half of the world's population is already infected with H. pylori. The pathogen is well adapted to the environment in the stomach and different courses of disease can be observed depending on various individual factors such as microbiome and immune status. Current therapies rely solely on antibiotics. However, resistance to therapy-relevant antibiotics makes it difficult to treat patients effectively, which is why alternative antibiotic-free therapy approaches are needed in the long term to supplement or replace antibiotics, such as with antimicrobial peptides (AMPs). To enable effective antibiotic-free eradication of H. pylori in the future, the efficacy of 13 AMPs against H. pylori was investigated. The peptides LL-37 and Nisin A were found to be the most effective candidates. By recording dose-response curves, an almost similar mean inhibitory concentration (IC50) in the lower micromolar concentration range was determined for LL-37 (~12 µM) and Nisin A (~11 µM). Furthermore, all AMPs were analyzed with regard to their cytotoxic and hemolytic activity as well as their sensitivity to the digestive enzyme pepsin present in the human stomach. To deliver the drug to the site of infection, a modified H. pylori strain was to be developed that can act as a Trojan horse and colonize in the immediate vicinity of the pathogen in order to release the active substance in a targeted manner upon contact with pathogenic H. pylori cells. To this end, the synthesis and secretion of the active ingredient is to be induced by messenger substances known as autoinducers (AI) released by the pathogenic H. pylori. LC-MS/MS analyses revealed that H. pylori synthesizes AI-2 as a messenger substance, but not AI-1 or AI-3. The attenuation of a pathogenic H. pylori strain should be achieved by deleting pathogenicity factors. For this purpose, three gene loci, two of which encode for the pathogenicity factors VacA and IceA2 and one for the enzyme LuxS, which is involved in the catalysis of a bacterial messenger substance, were deleted. A surface plasmon resonance spectroscopy confirmed the absence of VacA protein formation and LC-MS/MS analysis confirmed a significant reduction in the synthesis of the bacterial messenger substance AI-2. iceA2 deletion was confirmed by sequencing. Comparative in vitro infection experiments of human gastric mucosal cells were carried out with the Trojan generation H. pylori HP4 for reasons of time and cost. As intended, these showed no significant reduction in colonization efficiency of the Trojan HP4 compared to the wild type. However, the triggered cytokine titers (IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ und TNF-α) were similar, indicating that this Trojan generation is not yet sufficiently attenuated and needs to be further optimized. Therefore, the cagA gene coding for the main pathogenicity factor CagA was subsequently deleted and the strain H. pylori HP5 was generated. A western blot analysis confirmed that the generated Trojan HP5 no longer produces the CagA protein. Future studies will have to clarify whether this leads to a significant reduction in the pathogenicity parameters (IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-γ und TNF-α) or whether further deletions are required.

OpenAccess:
PDF
(additional files)