The DNA methylation-independent role of DNMT1 in cortical neuron development

Pitschelatow, Georg; Spehr, Marc; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion

doi:HT031451980

The DNA methylation-independent role of DNMT1 in cortical neuron development

Pitschelatow, Georg^RWTH*

2026

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Georg Pitschelatow, M. Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2026

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2026

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)^RWTH* ; Spehr, Marc (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2026-04-16

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2026-04292
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1033753/files/1033753.pdf

Einrichtungen

Projekte

GRK 2416 - GRK 2416: MultiSenses-MultiScales: Neue Ansätze zur Aufklärung neuronaler multisensorischer Integration (368482240) (368482240)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNMT1 (frei) ; DOCK7 (frei) ; branching (frei) ; corticogenesis (frei) ; development (frei) ; microtubule (frei) ; mitochondria (frei) ; neuron (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Mutationen im DNMT1(DNA-Methyltransferase 1)-Gen sind mit neurologischen Erkrankungen wie der hereditären sensorischen und autonomen Neuropathie Typ 1E (HSAN1E) sowie anderen neurodegenerativen Störungen assoziiert. Die zugrunde liegenden Mechanismen lassen sich jedoch nur unzureichend durch die klassische Funktion von DNMT1 als Erhaltungs-DNA-Methyltransferase in sich teilenden Vorläuferzellen erklären, was auf zusätzliche, bislang wenig verstandene Funktionen hindeutet. Neueste Befunde zeigen, dass DNMT1 nicht nur im Zellkern vorkommt, sondern auch im Zytosol lokalisiert ist. Dies legt nahe, dass DNMT1 neben seiner klassischen Rolle in der Genregulation auch an zytosolischen Prozessen beteiligt sein könnte, die für die neuronale Entwicklung relevant sind, und damit ein breiteres Funktionsspektrum dieses epigenetischen Schlüsselenzyms impliziert. Die große N-terminale Domäne, die an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt ist, deutet ebenfalls auf erweiterte Wirkmechanismen hin. So reguliert DNMT1 in postmitotischen, aus dem präoptischen Areal (POA) stammenden Interneuronen die Transkription durch Interaktion mit einem histonmodifizierenden Enzym und erhält dadurch deren polarisierte Morphologie während der Migration in den sich entwickelnden Kortex. Die neuronale Morphologie unterliegt während der gesamten Kortikogenese einer präzisen Kontrolle. Sie umfasst sowohl die Migrationsphase als auch die postmigratorische Reifung und hängt wesentlich von der dynamischen Umgestaltung des Zytoskeletts ab. Die Bildung von Neuriten und Verzweigungen erfordert eine streng regulierte Stabilität der Mikrotubuli und ist eng mit dem intrazellulären Transport verknüpft. Die Mikrotubulidynamik wird sowohl durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine sowie posttranslationale Tubulinmodifikationen gesteuert. Frühere Studien zeigten, dass DNMT1 die morphologische Reifung kortikaler exzitatorischer Neurone beeinflusst, wobei hypomorphe Dnmt1-Mutanten einen aberranten Verzweigungsphänotyp aufweisen. Die Mechanismen dieser Regulation waren jedoch bislang ungeklärt. Das Ziel dieser Dissertation war es daher, zu untersuchen, wie DNMT1 die neuronale Morphogenese während der frühen Kortikogenese reguliert. Zunächst wurde in dieser Arbeit bestätigt, dass DNMT1 die neuronale Verzweigung im sich entwickelnden Kortex in vivo beeinflusst. Anschließend wurden die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen in primären kortikalen Neuronen in vitro mithilfe verschiedener Knockdown-Ansätze untersucht, wobei der im initialen in vivo-Experiment beobachtete aberrante Verzweigungsphänotyp reproduziert wurde. Im Gegensatz dazu hat die Inhibition der DNA-Methylierungsaktivität von DNMT1 allein keinen Einfluss auf die neuronale Morphologie, was auf die Beteiligung nicht-kanonischer DNMT1-Funktionen hinweist. Es konnte ferner gezeigt werden, dass DNMT1 nicht nur im Zellkern, sondern auch im Zytosol lokalisiert ist, wo es mit dem mikrotubulistabilisierenden Protein DOCK7 interagiert. Knockdown-Experimente ergaben, dass DNMT1 und DOCK7 beide übermäßige Verzweigungen verhindern. Zudem beeinflussten sowohl Dnmt1- als auch Dock7-Knockdown Tubulin-Acetylierung (als Marker stabiler Mikrotubuli) sowie die Phosphorylierung des Mikrotubuli-destabilisierenden Proteins STMN1/Op18 (Stathmin/Oncoprotein 18). Da der intrazelluläre Transport eng an Mikrotubulidynamik gekoppelt ist, wurde als nächstes der Transport von Mitochondrien untersucht. Es wurde gezeigt, dass der mitochondriale Transport durch die reduzierte Expression von Dnmt1 oder Dock7 beeinflusst wird, ohne die mitochondriale Aktivität zu verändern. Weitere Experimente deuten darauf hin, dass der mitochondriale Transport auf der zytosolischen, DNA-Methylierungs-unabhängigen Funktion von DNMT1 basiert, ähnlich wie seine zuvor beschriebene nicht-kanonische Rolle bei der Regulation der neuronalen Morphologie. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass DNMT1 für die Tubulin-Acetylierung und die Phosphorylierung von STMN1/Op18 erforderlich ist, die beide mit der Mikrotubulistabilität korreliert sind. Diese Effekte werden wahrscheinlich durch die zytosolische Interaktion mit DOCK7 vermittelt und verdeutlichen, dass DNMT1 über seine kanonische nukleäre Funktion hinaus breitere und bisher unbekannte Rollen erfüllt. Demnach reguliert DNMT1 nicht nur nukleäre epigenetische Modifikationen, sondern übt auch nicht-kanonische zytosolische Funktionen aus, die mit mitochondrialem Transport und neuronaler Reifung verknüpft sind. Diese Erkenntnisse liefern neue Einblicke in DNMT1-assoziierte neurodegenerative Erkrankungen unabhängig von seiner DNA-Methylierungsaktivität.

Mutations in the DNMT1 (DNA methyltransferase 1) gene are associated with severe neurological disorders, such as hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1E (HSAN1E) and other neurodegenerative syndromes. However, the molecular mechanisms underlying these pathologies are difficult to explain solely by DNMT1’s classical DNA methylation-maintaining function in dividing progenitors, suggesting additional, yet poorly understood, roles. Recent findings indicate that DNMT1 is not only present in the nucleus but is located in the cytosol. This suggests that, in addition to its classical role in gene expression regulation, DNMT1 may also be involved in cytosolic processes relevant to neuronal development, implying a broader functional spectrum of this key epigenetic player. In this context, the understanding of how DNMT1 contributes to neuronal development beyond catalyzing DNA methylation becomes particularly important. Of note, DNMT1 contains a large N-terminal domain involved in protein-protein interaction, suggesting other modes of action. Indeed, DNMT1 exerts transcriptional control through its interaction with a histone-modifying enzyme in POA (Preoptic area)-derived postmitotic cortical interneurons, maintaining their polarized morphology during long range migration into the developing cortex. Neuronal morphology is tightly controlled across all stages of corticogenesis, encompassing both the migratory phase and the subsequent post-migratory period of morphological refinement. The precise shaping of neuronal morphology depends on dynamic cytoskeletal remodeling. Neurite formation and branching require tightly regulated microtubule stability and are intimately linked to intracellular trafficking. These microtubule dynamics are controlled both by cytosolic microtubule-associated proteins that stabilize or destabilize microtubules and by posttranslational tubulin modifications that fine-tune microtubule stability and motorprotein interactions. DNMT1 had been shown to impact the morphological maturation of cortical excitatory neurons. Dnmt1 hypomorphic cortical neurons show an abnormal branching phenotype. However, the mechanisms underlying this regulation remain largely unexplored. The central aim of this dissertation is therefore to elucidate how DNMT1 controls neuronal morphogenesis during early corticogenesis. To address this question, this thesis first confirmed that DNMT1 influences neuronal branching in the developing cortex in vivo, consistent with previous findings in Dnmt1 hypomorphic cortical neurons. Subsequently, the underlying molecular mechanisms were analyzed in primary cortical neurons in vitro using different knockdown approaches, reproducing the aberrant branching phenotype observed in the initial in vivo experiment. In contrast, blocking DNMT1’s DNA methylation activity alone does not impact the neuronal morphology, suggesting the involvement of non-canonical DNMT1 functions. It was then further shown that DNMT1 is localized not only in the nucleus but also in the cytosol, where it interacts with the microtubule stabilizer DOCK7. Knockdown of either protein indicated that both proteins similarly prevent excessive branching in cortical neurons. In addition, posttranslational microtubule modifications, such as tubulin acetylation indicative of stabilized microtubules, were affected by Dock7 depletion as well as by Dnmt1 knockdown. Moreover, both Dnmt1 and Dock7 knockdown impaired the phosphorylation of the microtubule destabilizer STMN1/Op18 (Stathmin/Oncoprotein 18). Since intracellular trafficking is coupled to microtubule dynamics, mitochondrial transport was examined next. It was demonstrated that mitochondrial trafficking is altered by repression of Dnmt1 or Dock7, whereas mitochondrial activity itself remains unaffected. Further experiments suggest that proper mitochondrial trafficking relies on DNMT1’s cytosolic, DNA-methylation-independent function, similar to its previously verified non-canonical role in regulating neuronal morphology. In sum, this work demonstrates that DNMT1 is required for tubulin acetylation and phosphorylation of STMN1/Op18, both of which correlated with microtubule stability. These effects are likely mediated through its cytosolic interaction with DOCK7, highlighting that DNMT1 fulfills broader and previously unrecognized roles beyond its canonical nuclear function. Accordingly, DNMT1 not only regulates nuclear epigenetic modifications but also carries non-canonical cytosolic functions linked to mitochondrial trafficking and neuronal maturation. These findings offer new insight into DNMT1-associated neurodegenerative syndromes, independent of its DNA-methylation activity.

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