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Development, application, and experimental validation of in silico strategies for knowledge-guided exploration of the protein sequence space = Entwicklung, Anwendung und experimentelle Validierung von in silico Strategien für die datengetriebene Exploration des Proteinsequenzraums
2026
Dissertation, RWTH Aachen University, 2026
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2026-07-14
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
MERGE (frei) ; Molekulardynamik-Simulationen (frei) ; Proteinfitnessvorhersage (frei) ; direct coupling analysis (frei) ; incremental molecular docking (frei) ; inkrementelles molekulares Docking (frei) ; machine learning (frei) ; maschinelles Lernen (frei) ; molecular dynamics simulation (frei) ; protein engineering (frei) ; protein fitness prediction (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
Kurzfassung
Protein Engineering ist unerlässlich, um maßgeschneiderte Biomoleküle, die für Anwendungen in der Industrie, Medizin und Wissenschaft entscheidend sind, bereitzustellen. Protein Engineering erfordert das Lösen eines komplexen kombinatorischen Problems, das normalerweise über Millionen von Jahren durch Evolution bewältigt wird. Datengetriebene Strategien bieten einzigartige Möglichkeiten das Optimierungsproblem umfassender als traditionelle Ansätze, wie die gerichtete Evolution, zu bearbeiten. Trotz ihres Potenzials finden diese Methoden jedoch nur vereinzelt Anwendung, da sie bei Datenknappheit unzuverlässig sind und es an Leitfäden zur Auswahl geeigneter Methoden fehlt. In dieser Arbeit wurde MERGE, eine neuartige Strategie basierend auf semi-überwachtem maschinellen Lernen (ML), entwickelt und implementiert, um die Einschränkungen traditioneller ML-Ansätze zu umgehen. In systematischen und ausgiebigen Benchmark-Studien überzeugte MERGE durch hohe Leistung, unabhängig von der Datenstruktur und -menge. MERGE erweitert nicht nur den bioinformatischen Werkzeugkasten, sondern ermöglicht datengetriebenes Protein Engineering, wenn traditionelle ML-Ansätze versagen (z. B. bei Datenknappheit oder Out-of-Distribution-Vorhersagen). Zusätzlich zur Leistungsbewertung überwachter ML-Modelle wurden nicht-überwachte Ansätze zur Hotspot-Identifizierung systematisch evaluiert. Es zeigte sich, dass die in silico Methoden den auf Zufallsmutagenese basierenden Ansätzen überlegen sind, da sie im Mittel eine 1.5- bis 7-fach höhere Trefferquote erzielten. Durch die systematische Analyse konnten die Stärken und Schwächen der untersuchten Methoden herausgearbeitet werden und ein Leitfaden, mit Hilfe dessen die Effizienz und Effektivität computergestützten Protein Engineerings optimiert wird, formuliert werden. Neben den ausgiebigen Leistungsuntersuchungen wurden Hotspots einer Cellulase und einem Nylon-abbauendem Enzym erfolgreich identifiziert. Zur Identifizierung kamen ein verallgemeinertes Potts-Modell und ein rationaler Ansatz, der inkrementelles Docking und Molekulardynamik-Simulationen kombinierte, zum Einsatz. Beide Ansätze führten mit geringem experimentellem Aufwand zu deutlich verbesserten Varianten. So konnte eine Cellulasevariante identifiziert werden, die eine 4.4-fach gesteigerte Aktivität und eine um 3.7 °C erhöhte Schmelztemperatur im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Durch den rationalen Ansatz wurden Substitutionen identifiziert, die die Aktivität der Polyamidase um bis zu 2.8-fach steigerten. Die Aktivität konnte durch Kombinieren mit weiteren Substitutionen auf 6.9-fach gesteigert werden.Protein engineering is essential to equip modern society with specialized biomolecules that are crucial for many applications in industry, medicine, and academia. The process involves solving a complex combinatorial optimization problem, which nature usually addresses over millions of years through evolution. Data-driven strategies offer unprecedented opportunities to tackle this optimization problem more profound than traditional strategies, such as directed evolution. However, their routine application is often impeded by their low reliability when data is scarce and missing guidelines for selecting appropriate methods. Within this work, a novel semi-supervised machine learning framework, MERGE, was developed and implemented to overcome limitations of traditional machine learning (ML) approaches. In systematic and exhaustive benchmark studies, MERGE demonstrated remarkable performance, independent of data structure and size. MERGE not only expands the toolbox of protein engineers but enables data-driven protein engineering when traditional ML approaches fail (i.e., scarce data situations or out-of-distribution prediction tasks). In addition to benchmark studies of supervised ML methods, the performance of unsupervised approaches for hot spot identification was systematically examined. By achieving on average 1.5- to 7-fold increased hit rates, in silico methods proved superior compared to random mutagenesis-like approaches. Systematic analysis gave deep insights into model behavior and led to the formulation of guidelines, which enable informed decision-making to enhance efficiency and effectiveness of computer-assisted protein engineering. Besides exhaustive benchmark studies, in silico hot spot identification was successfully applied for pinpointing fitness-enhancing substitutions of a cellulase and a nylon-degrading enzyme. While first was accomplished by consulting a statistical model resulting from direct coupling analysis, latter was achieved by pursuing a rational approach that combined incremental docking and subsequent molecular dynamics simulations. Both approaches led to highly improved variants with minimal experimental effort. Specifically, cellulase variants showed up to 4.4-fold increased activity and 3.7 °C enhanced melting temperature compared to the parental enzyme. Similarly, the rational approach identified substitutions that enhanced the activity of the polyamidase up to 2.8-fold. By combining identified substitutions with another substitution identified by epPCR, the specific activity of the polymer-degrading enzyme could be enhanced by 6.9-fold.
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
print
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT031572314
Interne Identnummern
RWTH-2026-07630
Datensatz-ID: 1040018
Beteiligte Länder
Germany
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