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Structure-function relation of the multifunctional plasma protein fetuin-A = Struktur-Funktions Relation des multifunktionalen Plasmaproteins Fetuin-A
2026
Dissertation, RWTH Aachen University, 2026
Genehmigende Fakultät
Fak01
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2026-04-13
Einrichtungen
- Institut und Lehr- und Forschungsgebiet Zell- und Molekularbiologie an Grenzflächen (925220)
- Lehr- und Forschungsgebiet Molekulare Zellbiologie der Pflanzen (161920)
- Fachgruppe Biologie (160000)
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
calcification (frei) ; fetuin (frei) ; mineralization (frei) ; phosphorylation (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
Kurzfassung
Fetuin-A ist ein multifunktionales im Serum vorkommendes Phospho-Glykoprotein. Eine seiner zentralen Aufgaben besteht darin, Kalziumphosphate im Blut zu binden und ihren Transport zu ermöglichen. Zwar ist bekannt, dass Fetuin-A in unterschiedlichen Phosphorylierungsgraden vorliegt, bislang war jedoch unklar, ob diese Modifikation dessen Fähigkeit zur Mineralbindung beeinflusst. Für andere Proteine mit ähnlicher Funktion, wie Osteopontin oder das Matrix-Gla-Protein, konnte ein solcher Zusammenhang bereits gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Phosphorylierung auf die Mineralbindungsfunktion von Fetuin-A zu untersuchen. Hierzu wurde rekombinantes Fetuin-A in ExpiCHO-S™ Zellen exprimiert und in vitro mittels einer von mir konstruierten, aktiven Variante der extrazellulären Kinase Fam20C phosphoryliert oder durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Der Phosphorylierungsstatus wurde anschließend mittels Phostag™ SDS-PAGE und massenspektrometrischen Analysen überprüft. Zur funktionellen Analyse kamen zwei Assays zum Einsatz: der CAPPI (Kalziumphosphat Präzipitations- Inhibitions-) Assay zur Bestimmung der Fähigkeit, übersättigte Kalzium- und Phosphatlösungen zu stabilisieren, sowie der T50-Assay zur Quantifizierung der Kalzifizierungsneigung in Lösung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorylierung von Fetuin-A seine Fähigkeit reguliert, Kalziumphosphat-Komplexe zu binden und so deren Ausfällung zu verhindern. Dephosphoryliertes Fetuin-A zeigte in beiden Assays eine reduzierte Aktivität, „hyper“phosphoryliertes Fetuin-A gesteigerte Aktivität. Damit konnte erstmals ein direkter funktioneller Zusammenhang zwischen dem Phosphorylierungsstatus von Fetuin-A und seiner mineralbindenden und -stabilisierenden Aktivität nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse haben weitreichende Implikationen für das Verständnis physiologischer Kalzifizierungsprozesse sowie für die Entwicklung potenzieller therapeutischer Strategien, bei denen modifiziertes oder rekombinantes Fetuin-A zum Einsatz kommen könnte.Fetuin-A is a multifunctional phospho-glycoprotein. One of its central roles is to bind calcium phosphates in the blood and facilitate their transport. Although it is known that fetuin-A exists in various phosphorylation states in the circulation, it remained unclear whether this post-translational modification affected its mineral-binding capacity. For other mineral-binding proteins, such as osteopontin or matrix Gla protein, such a functional link has already been described. The aim of this study was to investigate whether the phosphorylation status of fetuin-A influenced its ability to bind mineral. To this end, recombinant fetuin-A was expressed in ExpiCHO-S™ cells and in vitro phosphorylated by a self-engineered, active variant of the extra-cellular kinase Fam20C, or in vitro dephosphorylated using alkaline phosphatase. The phosphorylation status was confirmed by Phostag™ SDS-PAGE and protein mass spectrometry. Functional analysis was performed using two in-house developed assays: the calcium phos-phate precipitation inhibition - CAPPI assay, which measures the ability of a reagent to stabi-lize saturated calcium (5 mM) and phosphate (3 mM) solutions, and the T50 assay, which quantifies the propensity of a solution to undergo calcification. The results clearly demonstrate that phosphorylation regulates the fetuin-A mineral-binding function. Dephosphorylated fetuin-A showed reduced, and in-vitro “hyper”phosphorylated fetuin-A had increased capacity to inhibit calcium phosphate precipitation in both assays. This study thus provides the first direct functional evidence that the phosphorylation status of fetuin-A critically regulated its mineral-binding behavior. These findings have important implications for understanding physiological calcification processes and may inform the development of therapeutic strategies involving modified or recombinant forms of fetuin-A.
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
print
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT031612381
Interne Identnummern
RWTH-2026-08776
Datensatz-ID: 1041643
Beteiligte Länder
Germany
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