Reaction and protein engineering employing a carbonyl reductase from candida parapsilosis

Jakoblinnert, Andre; Schwaneberg, Ulrich

doi:32509

Reaction and protein engineering employing a carbonyl reductase from candida parapsilosis = Reaktions- und Proteinengineering einer Carbonyl-Reductase aus Candida parapsilosis

Jakoblinnert, Andre

2012 & 2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Andre Jakoblinnert

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

UmfangV, 160 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012

Zsfassung in dt. und engl. Sprache. - Prüfungsjahr: 2012. - Publikationsjahr: 2013

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-09-21

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-44885
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/211241/files/4488.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Carbonyl-Reductase <NADPH> (Genormte SW) ; Proteindesign (Genormte SW) ; Substratspezifität (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Reaktionsdesign (frei) ; Enzymstabilität (frei) ; chirale Alkohole (frei) ; protein engineering (frei) ; reaction egineering (frei) ; carbonyl reductase (frei) ; chiral alcohol (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Herstellung chiraler Alkohole für die Synthese von Pharmazeutika gewinnt an Bedeutung in der chemischen Industrie. Biokatalytische Verfahren zur Bereitstellung dieser Komponenten durch asymmetrische Reduktion von preiswerten Ketonen stellt eine kompetitive Syntheseroute im Hinblick auf Selektivität, Produktivität, Kosteneffizienz und Nachhaltigkeit dar. Die Hauptherausforderungen zur Implementierung eines ökonomisch machbaren biokatalytischen Prozesses zur Ketonreduktion werden hier behandelt. Einerseits werden die äußeren Reaktionsbedingungen so verändert, dass die Ressourcen effizient genutzt werden und hohe Raum-Zeit-Ausbeuten möglich sind. Andererseits wird das Enzym, welches die Reaktion katalysiert, so entwickelt, dass es den Prozesskenngrößen besser gerecht werden kann. Diese Thesis hat die Carbonylreduktase aus der Hefe Candida parapsilosis (CPCR2) zum Gegenstand, welche ein breites Substratspektrum aufweist und sehr stereoselektiv ist. Zu aller erst musste die molekulare Identität der CPCR2 geklärt werden.Computergestützte Modellierung machte die Voraussage von Indikatorsubstraten möglich, die wiederum, experimentell verifiziert, eine Zuordnung von Sequenz und Funktion zweier Isoenzyme(CPCR1, CPCR2) ermöglichte. Die Verwendung von CPCR2 in einem neuartigen Reaktionskonzept für die Produktion von chiralen Alkoholen in molaren Mengen durch ein apparativ schlichtes Verfahren und unkomplizierte Produktaufarbeitung wurde hier erstmals gezeigt. Die Entwicklung des sogenannten „Neat Substrate System“, worin ausschließlich reine Substrate und der Ganzzellkatalysator verwendet werden, beinhaltete die Identifizierung und Optimerung der beeinflussenden Reaktionsparameter. Das Konzept wurde verschiedene Substrate,zwei weitere Enzyme und einen alternativen Reaktionsmodus erweitert. Das „Neat Substrate System“ ist das erste Beispiel für eine biokatalytische Alkoholproduktion in einem Reaktionsmedium ohne jegliches zusätzliches Lösungsmittel. Die Vielseitigkeit und Effektivität dieses System macht eine breite Anwendung in der organischen Synthese zur Herstellung chiraler Zwischenstufen möglich. Proteinengineering wurde in den letzten Jahren erfolgreich verwendet um z.B. Aktivität, Stabilität sowie Selektivität von Ezymen zu verbessern. Hier wird das Enzym CPCR2 erstmals einem semi-rationalen Proteinengineering unterzogen um das Substartspektrum zu erweiteren und die Stabilität zu steigern. Die Etablierung eines Proteinexpressionsverfahrens sowie Aktivitätstests im Mikrolitermassstab sind eine Voraussetzung die CPCR2-Varianten durchzumustern. Der semi-rationaler Ansatz lieferte eine Aktivitätssteigerung hinsichtlich der Umsetzung von methylsubstituierten Cyclohexanonen. Die Variante CPCR2-L119M zeigte im Vergleich zum Wildtyp eine siebenfach höhere Aktivität zu 2-Methylcyclohexanon. Der experimentelle Befund konnte anhand von computergestützten Simulationen erklärt werden. Die Studie zeigt, dass strukturell konservative Austausche in der Substratbindungstasche das Substratspektrum stark beeinflussen können. Vorrausgehende Untersuchungen zur Stabilität von CPCR2 zeigten eine starke Inaktivierung an wässrig-organischen Grenzflächen. Für dier Enzymstabilisierung durch Proteinengineering wurde zuerst ein rein rationaler Ansatz gewählt, welcher zu der Doppelmutante CPCR2-(A275N, L276Q) führte, die sowohl in Aktivität als auch in Stabilität verbessert war. Die Variante diente als Ausgangspunkt für eine semi-rationale Optimierung durch Sättigungsmutagenese der Positionen 275 & 276. Die beste Variante CPCR2-(A275S, L276Q) zeigte eine Erhöhung der Aktivität um den Faktor 1,4, sowie eine erhöhte Thermoresistenz (deltaT50 +5.2°C). Zusätzlich wurde die Grenzflächenstabilität um den Faktor 1,6 erhöht. Die Analyse der Mutationen zeigte eine Kooperativität der Positionen 275 und 276, welche beide an der Interaktionsfläche des Dimers bzw. nahe der Bindungstasche liegen. Experimentelle Daten sowie computergestützte Analysen zeigten, dass die Stabilisierung hauptsächlich durch die Position 275 beeinflusst wurde, wohingegen die Aktivierung maßgeblich von Position 276 verursacht wurde. Strukturelle Untersuchungen zeigten zudem, dass die stabilste Einzelmutante CPCR2-(A275T) eine Wasserstoffbrücke zwischen den Monomeren ausbildet, welche die erhöhte Stabilität erklärt. Der Einfluss von Position 276 konnte insoweit rationalisiert werden, dass die Aminosäuren an dieser Position in direktem Kontakt zum Substratmolekül stehen und somit die Aktivität modulieren können. In dieser Arbeit wurde die Zuordnung von Sequenz zu Funktion für die Identifizierung von CPCR1 und CPCR2 erreicht. Des Weiteren wurde ein neuartiges Reaktionskonzept, das „Neat Substrate System“, entwickelt und erweitert für mögliche breite Anwendung. Außerdem wurden mittels Proteinengineering Varianten von CPCR2 erzeugt mit erweitertem Substratspektrum, sowie deutlich erhöhter Stabilität und Aktivität.

Biocatalytic manufacturing of chiral alcohols as building blocks for the synthesis of pharmaceuticals and fine chemicals is of growing relevance in the chemical industry. The biocatalytic route to provide these compounds by asymmetric reduction of cheap ketones constitutes a competitive synthesis route with respect to selectivity, productivity, cost-effectiveness and sustainability. Major challenges to establish economically feasible biocatalytic processes are addressed; on the one hand by reaction engineering facilitating efficient use of the resources and high space-time yields and on the other hand by protein engineering to supply appropriate enzymes to meet the process benchmarks. In this thesis, the characterization of a promising carbonyl reductase from the yeast Candida parapsilosis (CPCR2), which is able to selectively reduce various ketones to the corresponding alcohols, is presented. Molecular modeling permitted the prediction of indicator substrates and experimental verification enabled the assignment of sequence to function of two CPCR isoenzymes (CPCR1 & CPCR2). Applying CPCR2, a novel concept for producing chiral alcohols in molar amounts via an easy operation mode and straightforward work-up is introduced. Throughout the development of this so-called “neat substrate system”, which is composed of pure substrates and the whole cell catalyst, the key reaction parameters were elucidated and optimized. Moreover, the concept was further expanded towards different substrates, other ketone reducing enzymes and alternative operation modes. The “neat substrate system” demonstrates the first example for efficient biocatalytic alcohol production in a reaction medium lacking any bulk solvent. The versatility and efficiency of this system, developed here, might leverage this technique to become widely applicable. Protein engineering has become a powerful tool for tailoring enzymes to meet certain requirements like increased activity, stability or selectivity. In this thesis, CPCR2 was subjected to semi-rational protein engineering for the first time. The establishment of an appropriate protein expression procedure and a NADH-depletion activity assay in microliter formate enabled screening of CPCR2 variant libraries. The main engineering goals were the enlargement of the substrate spectrum and stabilization of the enzyme. A semi-rational approach led to substantial activity increase towards cyclohexanone substrates by exchange of leucine to methionine located in the substrate binding pocket (CPCR2-L119M). In particular, kcat for the reduction of 2-methyl cyclohexanone was increased more than 7-fold. The effect was explained on the molecular level by in silico substrate docking. The overall findings led to the assumption that more conservative amino acid substitutions might be more appropriate for altering the substrate scope of CPCR2. This may guide future strategies to modify the substrate acceptance of this enzyme class. Former studies on CPCR2 revealed severe inactivation at water-organic interfaces, which limits the application of the enzyme in biphasic systems. Previous attempts to stabilize the enzyme by rational protein engineering led to the double mutant CPCR2-(A275N, L276Q) showed increased stability as well as activity. This variant was adopted as a starting point for semi-rational optimization. Simultaneous site saturation and screening of these two positions revealed variants with improved activity and stability superior to the previous variant. The best variant found was CPCR2-(A275S, L276Q) exhibiting 1.4-fold higher activity, a deltaT50 of +5.2 °C in thermoresistance and 1.6-fold increased interfacial stability. Analysis of the single mutations suggested cooperativity of the amino acids at position 275 and 276, which are located at the dimer interface and close to the binding pocket. Experimental data as well as computational analysis indicated a contribution to stability by position 275 and an impact on activity by position 276. Structural investigation of the model predicted the establishment of an inter-subunit hydrogen bond by threonine at position 275 being responsible for stabilization and direct interactions of residue 276 with the substrate modulating activity. Taken together, a sequence to function assignment was achieved for identification of CPCR1 and CPCR2. A novel concept for biocatalytic alcohol manufacture, the “neat substrate system”, was developed and expanded to possible broad applications. CPCR2 was subjected to protein engineering yielding new variants with enlarged substrate scope, increased activity and stability.

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