Sensibilization of dendritic cell-like antigen presenting cells by low-molecular weight drugs : molecular characterization and function of the dendritic cell specific organic anion transporting polypeptide OATP5A1

Sebastian, Katrin; Zwadlo-Klarwasser, Gabriele-Claudia; Elling, Lothar

doi:32171

Sensibilization of dendritic cell-like antigen presenting cells by low-molecular weight drugs : molecular characterization and function of the dendritic cell specific organic anion transporting polypeptide OATP5A1 = Sensibilisierung dendritischer Zellen-ähnlicher Antigen-präsentierender Zellen durch niedermolekulare Arzneistoffe : molekulare Charakterisierung und Funktion des von dendritischen Zellen exprimierten organischen Anionen-transportierenden Polypeptids OATP5A1

Sebastian, Katrin^RWTH*

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Katrin Sebastian

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangXI, 129 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Zwadlo-Klarwasser, Gabriele-Claudia (Thesis advisor)^RWTH* ; Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-02-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-45034
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/211447/files/4503.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Arzneimittelnebenwirkung (Genormte SW) ; Sensibilisierung <Immunologie> (Genormte SW) ; Dendritische Zelle (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Transmembrantransportprotein (frei) ; SLCO5A1 (frei) ; adverse drug reactions (frei) ; in vitro-sensibilization (frei) ; dendritic cells (frei) ; transmembrane-transportproteins (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
rvk: WW 3880 * WD 4150 * VW 9007* XI 2087

Kurzfassung
Adverse drug reactions (ADRs), which include drug allergic reactions, are a common clinical problem. Delayed-type hypersensitivity (DTH) reactions are T-cell-mediated type IV allergic reactions, which generally occur after 24h to 72h of the drug intake, and the skin is the major organ targeted by these reactions. Dendritic cells (DCs) represent a key player in the elicitation of a T cell response by presenting antigens to T cells. Low-molecular weight drugs are only recognized as antigens if they are covalently bound to proteins, such as serum albumin, thus, building a hapten-carrier-complex. In contrast, prohaptens need prior metabolization to become the nominative antigen. Furthermore, the drug has to be internalized into the cell. Polar substances are transported by specific transporter proteins. The organic anion transporting polypeptide (OATP) family (gene symbol: SLCO) represents influx transmembrane transporters expressed in various tissues, including the liver, kidney and brain. They mediate the sodium-independent transport of a diverse range of mainly amphipathic organic compounds, including bile acids, steroid conjugates, thyroid hormones, anionic peptides, and numerous other drugs. The first part of this thesis analyzed whether the sensitization potential of drugs by antigen-presenting cells can be measured in vitro and whether these systems are also capable to detect drugs acting as prohaptens. Model compounds, such as beta-lactams and sulphonamides, drugs most frequently involved in DTH reactions, were co-incubated with THP-1, MUTZ-LC, or primary monocyte–derived dendritic cells (moDCs) for 48h. Subsequently, expression of selected marker genes (IL-8, IL-1beta, CES1, NQO1, GCLM, PIR and TRIM16) was studied by quantitative real time PCR. Benzylpenicillin and phenoxymethylpenicillin were recognized as sensitizing compounds because they are capable of inducing the mRNA expression of these genes in moDCs and in THP-1 cells (except for IL-8) but not in MUTZ-LC. Ampicillin stimulated the expression of some marker genes in moDCs and THP-1 cells. Sulfamethoxazole (SMX) did not affect the expression of these genes in THP-1 cells. However, in moDCs, PIR was enhanced and there was an increase of the release of IL-8. These data reveal that novel in vitro DC based assays might play a role in the evaluation of the allergenic potential of novel drug compounds, but these systems seem to lack the ability to detect the sensitizing potential of prohaptens such as SMX. Regarding their sensitivity, moDCs seem to be superior compared with THP-1 and MUTZ-3 cell lines. The second part of this thesis analyzed the human OATP family member OATP5A1, a twelve transmembrane-spanning polypeptide, because preliminary studies revealed that the expression of this transporter compared to other OATPs was highly increased in primary mature DCs. Due to the lack of a suitable commercially available antibody, protein characterization and functional analysis have not yet been performed. It was the aim of this study to molecularly characterize human OATP5A1 expressed in two expression systems - genetically modified Hela cells (‘FlpIn T-Rex-Hela’) and oocytes of the south-african clawed frog Xenopus laevis. Furthermore, evidence regarding a possible OATP5A1 function should be provided. Transcriptional gene expression analysis revealed that SLCO5A1 expression is correlated with the differentiation status of primary blood cells. Moreover, SLCO5A1 expression was found to be increased in some melanoma cell lines. The contact sensitizer TNBS decreased the SLCO5A1 expression in moDCs. Molecular analysis of OATP5A1 revealed a core- and complex-N-glycosylated polypeptide monomer which could be localized in the cytosol and on the plasma membrane. Transport studies with classical OATP substrates could not identify any of these substrates (e. g. arachidonic acid, estrone-3-sulfate) as target for OATP5A1. Inducible expression of OATP5A1 in Hela cells led to an inhibitory effect on cell proliferation. Gene expression profiling with these cells identified genes that are mainly involved in cell adhesion and in both system- and anatomical structure development. Furthermore, a single nucleotide polymorphism of amino acid 33, leading to the exchange of leucine to phenylalanine, revealed no differences regarding protein expression and function when compared to the wild-type. In conclusion, evidence is provided that OATP5A1 might be a non-classical OATP family member, which is involved in biological processes that require the reorganization of the cell shape, such as differentiation and migration.

Unerwünschte Arzneimittelnebenwirkungen (UAW) beschreiben ein bekanntes klinisches Problem. Auf Arzneimittelallergien beruhende UAW werden den Typ-B-UAW zugeordnet. Dazu gehört die T-Lymphozyten-vermittelte Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ, die sich vor allem an der Haut manifestiert. Hierbei spielen dendritische Zellen (DCs) eine entscheidende Rolle, da sie als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) die T-Zellantwort auslösen. Der niedermolekulare Arzneistoff muss zur Bildung eines Hapten-Carrier-Komplexes an ein körpereigenes Trägerprotein gebunden werden um als Antigen präsentiert werden zu können. Sogenannte Prohaptene müssen zunächst metabolisiert werden um als Antigen zu wirken. Arzneimittel müssen zudem in die Zelle aufgenommen werden um als Antigen präsentiert werden zu können. Bei polaren Substanzen erfolgt dies über spezifische Transportproteine. Solch eine Klasse von Arzneimitteltransportern stellen die transmembranären, Natrium-unabhängigen Influx-Transporter der OATP-Familie (Organische Anionen-Transport-Polypeptide, Gensymbol: SLCO) dar, die u. a. in der Leber, der Niere und dem Gehirn vorkommen. Der erste Teil dieser Dissertation geht der Frage nach, inwieweit das Sensibilisierungspotenzial von Arzneimitteln durch APCs in vitro gemessen werden kann und ob auch Prohaptene erfasst werden können. Für die in vitro-Versuche wurden Modell-Substanzen, Beta-Lactam-Antibiotika und ein Sulphonamid, mit primären von Monozyten-abstammenden dendritischen Zellen (moDCs), THP-1 Zellen und MUTZ-Langerhans Zellen (MUTZ-LCs) für 48h koinkubiert. Anschließend wurde die Expression ausgewählter Gene (IL-8, IL-1beta, CES1, NQO1, GCLM, PIR, TRIM16) mittels quantitativer RT-PCR untersucht. Benzylpenicillin und Phenoxymethylpenicillin wurden als sensibilisierende Arzneistoffe identifiziert, da sie die mRNA-Expression der zuvor genannten Gene in THP-1 Zellen und moDCs, mit Ausnahme von IL-8, induzieren konnten. Ampicillin dagegen stimulierte nur die Expression einiger Gene in diesen Zellen. Sulfamethoxazol hatte keinen Einfluss auf die Genexpression mit Ausnahme von PIR in moDCs. Die mRNA Expression von IL-8 korrelierte mit seiner Proteinexpression in moDCs. Diese Daten zeigen, dass neu entwickelte in vitro DC-basierte Methoden eine Rolle in der Evaluation des sensibilisierenden Potenzials von Arzneistoffen spielen könnten, wobei moDCs im Vergleich zu THP-1 und MUTZ-LCs besser geeignet zu sein scheinen. Allerdings konnte mit diesen Modellen das sensibilisierende Potenzial von Prohaptenen nicht nachgewiesen werden. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde das Influx-Transportprotein OATP5A1 untersucht, weil es sich in Vorarbeiten belegen ließ, dass dieser Transporter im Vergleich zu anderen OATPs sehr stark von reifen DCs exprimiert wird. Da aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper nur wenig über diesen Transporter auf Proteinebene bekannt ist, war es Ziel dieser Arbeit OATP5A1 mithilfe von Expressionssystemen molekular zu charakterisieren und seine mögliche Funktion näher zu analysieren. Genexpressionsstudien zeigten, dass die Expression von SLCO5A1 mit dem Differenzierungsstatus primärer Blutzellen korreliert und dass die SLCO5A1-Expression in einigen Melanom-Zelllinien erhöht ist. Das Kontaktallergen TNBS reduzierte die SLCO5A1-Expression in moDCs. Die molekulare Analyse von OATP5A1, exprimiert in zwei Expressionssystemen (genetisch modifizierten Hela-Zellen und Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis), identifizierte ein Glykoprotein-Monomer, welches sowohl im Cytosol als auch an der Plasmamembran lokalisiert war. Transportexperimente konnten keine klassischen OATP-Substrate (z.B. Arachidonsäure, Estron-3-sulfat) als zu transportierende Substanz für OATP5A1 identifizieren. Die in Hela-Zellen induzierte OATP5A1-Expression führte zu einer geringen Hemmung der Zellproliferation. Mithilfe einer Exon-Genarray-Expressionsstudie konnten in diesen Zellen durch SLCO5A1-induzierte Gene identifiziert werden, die hauptsächlich an Prozessen der System- und anatomischen Struktur-Entwicklung, sowie der Zelladhäsion beteiligt sind. Ein weiterer Befund dieser Arbeit war, dass, vergleichend mit dem Wildtyp, ein in OATP5A1 eingeführter Einzelnukleotidpolymorphismus an Aminosäureposition 33, der zu einem Austausch von Leucin zu Phenylalanin führte, keinen Unterschied hinsichtlich Proteinexpression und Funktion erkennen ließ. Zusammenfassend lassen die Daten vermuten, dass OATP5A1 ein untypisches OATP-Mitglied ist, welches in biologische Prozesse, die eine Reorganisation der Zellform erfordern, z. B. Differenzierung und Migration, involviert ist.

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