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| 100 | 1 | _ | |0 P:(DE-82)102344 |a Willnow, Sophie |b 0 |e Author |
| 245 | _ | _ | |a Enzymatische Alkinfunktionalisierung zur Markierung und Identifizierung von Protein-Methyltransferase-Substraten |c vorgelegt von Sophie Willnow |h online, print |
| 246 | _ | 3 | |a Enzymatic alkyne-functionalization for labeling and identification of protein methyltransferase substrates |y English |
| 260 | _ | _ | |a Aachen |b Publikationsserver der RWTH Aachen University |c 2013 |
| 300 | _ | _ | |a VIII, 168 S. : Ill., graph. Darst. |
| 336 | 7 | _ | |a Dissertation / PhD Thesis |0 PUB:(DE-HGF)11 |2 PUB:(DE-HGF) |b phd |m phd |
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| 502 | _ | _ | |o 2012-07-06 |a Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012 |g Fak01 |
| 520 | 3 | _ | |a Proteine werden nach der Translation auf verschiedene Weisen modifiziert, indem sie kovalent mit chemischen Gruppen oder anderen Proteinen verknüpft werden. Durch diese posttranslationalen Modifikationen können Enzymfunktionen moduliert und Signale übertragen werden, z.B. im Histoncode. Auch die Methylierung verschiedener Aminosäuren geschieht posttranslational. Die Übertragung von einer bis drei Methylgruppen vom Cofaktor S-Adenosyl-L-methionin (AdoMet) auf verschiedene Aminosäurereste, u.a. Lysin, Arginin und Glutamin, wird durch Methyltransferasen (MTasen) katalysiert. Methylierte Aminosäuren verursachen keine große Konformationsänderung des Proteins, bilden aber neue Interaktionsflächen für sogenannte Methyleffektoren. Diese können damit den Methylierungszustand eines Proteins erkennen und in eine weitere zelluläre Antwort übersetzen. Methylierungen können durch Demethylasen rückgängig gemacht werden. Die geringe Größe und die schlechte Detektierbarkeit von radioaktiv markierten Methylgruppen verhindern bis jetzt eine umfassende Analyse von MTasen und ihren Substraten. In dieser Arbeit wurde daher ein neues zweistufiges Markierungsverfahren für MTase-Substrate entwickelt und angewandt. MTasen akzeptieren nicht nur den natürlichen Cofaktor AdoMet, sondern übertragen auch verlängerte Seitenketten von synthetischen Analoga auf ihre Substrate. Eine genügend hohe Übertragungsaktivität wird dann erreicht, wenn die Seitenkette klein ist und eine aktivierende Mehrfachbindung in Nachbarschaft zum Substitutionszentrum trägt. Auch der Austausch des zentralen Schwefels durch Selen führt zu einer deutlichen Aktivitätssteigerung. In dieser Arbeit wurde eine Sammlung von Cofaktoranaloga mit der Protein-MTase Dim-5 getestet. Nur mit dem Cofaktoranalogon SeAdoPropin, das eine Propargylgruppe enthält, war eine vollständige Modifikation eines Testpeptids in kürzester Zeit möglich. Dies liegt an der kleinen Seitenkette und der akzeptablen Stabilität des Cofaktors sowie an der Aktivierung durch das Selenonium-Zentrum und die benachbarte Dreifachbindung. Mit allen anderen getesteten Cofaktoranaloga war die Reaktion langsamer und der Umsatz nicht vollständig. Terminale Alkine können unter Triazolbildung in der Kupfer-katalysierten Azid-Alkin Cycloaddition (CuAAC) kovalent mit Aziden verknüpft werden. Diese Reaktion verläuft unter so milden Bedingungen mit so großer Geschwindigkeit ab, dass auch Alkin-funktionalisierte Proteine mit Azid-derivatisierten Markierungsreagenzien umgesetzt werden können. Bei der CuAAC handelt es sich um eine bioorthogonale Reaktion. Sie wurde in dieser Arbeit untersucht und für die Markierung von Proteinen verwendet. Dabei zeigte sich, dass besonders der Ligand tris-(Hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (THPTA) die Reaktion wesentlich beschleunigt und gleichzeitig Proteine vor einem durch Cu(I) verursachten Abbau schützt. Im zweistufigen Markierungsverfahren wurden in der Folge Protein-Substrate zunächst mit SeAdoPropin Alkin-funktionalisiert. Im zweiten Schritt folgte dann die chemische Markierung der modifizierten Proteine mit Azid-derivatisierten Fluorophoren oder Biotin in der CuAAC. Das zweistufige Markierungsverfahren wurde erfolgreich mit verschiedenen MTasen und ihren Substraten durchgeführt: mit den Lysin-MTasen Dim-5, Clr4, G9a und Set7/9, der Arginin-MTase PRMT1 und der Glutamin-MTase PrmC. Es zeigte sich, dass SeAdoPropin von vielen Protein-MTasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten verwendet werden kann. Zuletzt wurde das zweistufige Markierungsverfahren in die Methoden der Proteomforschung integriert, um ein Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von Substraten von Protein-MTasen zu entwickeln. Die Markierung im Proteinlysat wurde mit der bakteriellen MTase PrmC untersucht, indem die bekannten Substrate RF1 und RF2 identifiziert werden sollten. Nach Fluoreszenzmarkierung der Substrate im Lysat erfolgte die Auftrennung mit 2D-Gelelektrophorese und die massenspektrometrische Identifizierung interessanter Proteinflecken. Hierbei konnte RF2 als Substrat identifiziert werden. Zusätzlich wurden mit Biotin markierte Proteine mit Magnetpartikeln aus dem Lysat isoliert und massenspektrometrisch analysiert. RF1 konnte so als Substrat identifiziert werden. Zum Abschluss wurden Substrate der humanen Lysin-MTase Set7/9 auf einem Protein-Array markiert. Auf diese Weise wurden fast 300 Substratkandidaten ermittelt, die aber weiterer Überprüfungen bedürfen. Grundsätzlich kann das zweistufige Markierungsverfahren mit Methoden der Proteomforschung verknüpft werden. Bei allen Methoden muss jedoch die Sensitivität der Methodik erhöht werden. Insgesamt konnte in dieser Arbeit das zweistufige Markierungsverfahren wirkungsvoll zur Markierung von Protein-MTase-Substraten eingesetzt werden. In Zukunft könnte es bei der Identifizierung neuer Substrate Anwendung finden. |l ger |
| 520 | _ | _ | |a After translation, proteins are modified in many ways by being coupled covalently to chemical groups or other proteins. These posttranslational modifications modulate enzyme functions and can transmit signals, e.g. in the histone code. Protein methylation is one example of a posttranslational modification. The transfer of one to three methyl groups from the cofactor S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to different amino acid residues, e.g. lysine, arginine or glutamine, is catalyzed by methyltransferases (MTases). The methylation of amino acids does not result in a major change of conformation, but rather creates new interaction sites for so-called methyl effectors. These can recognize the methylation state of a protein and translate this signal into a cellular response. The methylation is reversed by demethylases. To date, the small size and the poor detectability of radioactively labeled methyl groups prevent a comprehensive analysis of MTases and their substrates. Thus we took the task to develop a novel two-step labeling method for MTase substrates and with this approach, labeled the substrates of selected MTases in complex samples. Protein MTases not only accept the natural cofactor AdoMet, but can also transfer elongated side chains from synthetic analogs to their substrates. A small side chain and an activating double or triple bond located in proximity to the substitution center provide a sufficient high transfer activity. Also, the exchange of the central sulfur atom with selenium leads to a considerable increase in activity. In this work, a collection of cofactor analogs was tested with the protein MTase Dim-5. Only with the cofactor analog SeAdoPropyne, containing a propargyl group, a complete modification of a test peptide was achieved. This is due to the small side chain and the acceptable stability of the cofactor analog, as well as the activation by the selenonium center and the neighboring triple bond. Other cofactor analogs tested showed lower reaction rates and did not lead to full conversion. Terminal alkynes can be coupled to azides in the Copper-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC), resulting in the formation of triazoles. Reacting under mild conditions with very high rates, the CuAAC can be used to couple alkyne-functionalized proteins to azide-derivatized labeling reagents. The CuAAC is a bioorthogonal reaction and its use for protein labeling was investigated in this work. It became clear that especially the ligand tris-(hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) accelerated the reaction and protected proteins against Cu(I)-mediated degradation. In our two-step labeling approach protein substrates were first alkyne-functionalized using SeAdoPropyne. Subsequently, proteins were labeled chemically using CuAAC with azide-derivatized fluorophores or biotin. This two-step method was successfully applied to different MTases and their substrates: to the lysine MTases Dim-5, Clr4, G9a and Set7/9, the arginine MTase PRMT1, and the glutamine MTase PrmC. Thus, SeAdoPropyne can be utilized by many protein MTases with different substrate specificities. Lastly, the two-step labeling approach was embedded into standard proteomic methods to develop a procedure for the isolation and identification of substrates of protein MTases. Labeling in protein lysate was analyzed using bacterial MTase PrmC by identifying its two known substrates RF1 and RF2. Subsequent to fluorescence labeling samples were separated via 2D gel electrophoresis followed by mass spectrometry-based identification of spots of interest. This way, RF2 could be identified as a substrate. In addition, biotin-labeled proteins were isolated from lysate using magnetic particles and were analyzed by mass spectrometry. Here, RF1 could be identified as a substrate. Finally, substrates of human lysine MTase Set7/9 were labeled on a protein array leading to almost 300 still to be confirmed substrate candidates. In principle, the two-step labeling method can be linked to proteomic methods. However, all techniques lack sensitivity, which needs to be enhanced in further studies. All in all, the two-step labeling method can be effectively used to label protein MTase substrates. In the future it should be applied to the identification of novel substrates. |l eng |
| 591 | _ | _ | |a Germany |
| 650 | _ | 7 | |a Click-Chemie |2 SWD |
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