Engineering of cytochrome P450 monooxygenases for application in phenol synthesis

Dennig, Alexander; Schwaneberg, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-49778

Engineering of cytochrome P450 monooxygenases for application in phenol synthesis = Entwicklung von Cytochrom P450 Monooxygenasen zur Anwendung in der Phenolsynthese

Dennig, Alexander (Author)

2013 & 2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Alexander Dennig (geb. Todt)

ImpressumAachen 2013

Umfang212 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Prüfungsjahr: 2013. - Publikationsjahr: 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-12-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-49778
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/229051/files/4977.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Cytochrom P-450 (Genormte SW) ; Phenol (Genormte SW) ; Proteindesign (Genormte SW) ; Biokatalyse (Genormte SW) ; Regioselektivität (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Monooxygenase (frei) ; P450 Monooxygenasen (frei) ; Protein Engineering (frei) ; P450 monooxygenases (frei) ; regioselectivity (frei) ; biocatalysis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
The field of biocatalytic synthesis is of growing importance for the development of new and environmentally friendly synthetic routes to bulk and fine chemicals. P450 monooxygenases play an evident role in the functionalization of non-activated C-H atoms, a reaction that remains a major challenge in the field of organic chemistry. For instance, the synthesis of phenol with benzene as educt is inefficient and only profitable due to the high demand for the acetone byproduct. This work covers the engineering of the bacterial monooxygenase P450 BM3 from Bacillus megaterium towards the aromatic hydroxylation of benzenes. The main objective of this study was to develop an efficient P450 catalyst that is capable of producing o-phenols that are important building blocks for the synthesis of pharmaceuticals, plastics and vitamins. For this purpose, novel P450 BM3 variants with superior performance (e.g. >28-fold increased activity, more efficient use of the NADPH cofactor and a broader substrate spectra for benzene substrates) have been identified. Thirty putative substrates have been investigated for conversions with variant M2 (R47S, Y51W, I401M) and 12 benzene derivates were additionally subjected to detailed characterizations with the WT enzyme and generated variants. In particular, the hydroxylation of anisole with variant M3 (R47S, Y51W, A330F, I401M) was very efficient and selective (>95% o-position) reaching product concentrations higher than 1 g L-1 and a TTN exceeding 10000. Besides the broadened substrate spectrum of P450 BM3 and the development of a protocol for preparative scale synthesis of phenols, the influence of commonly employed co-solvents such as DMSO was investigated. Unexpectedly, the best results for conversion of toluene to o-cresol were obtained without any co-solvent allowing a more sustainable route to o-phenols. A co-solvent free biocatalytic approach is cost-effective and allows a simplified purification of products. The catalytic characterization of P450 variants was complemented by docking studies to generate a hypothesis that explains the observed hydroxylation patterns. It was possible to show that the aromatic hydroxylation of benzene is governed through aromatic interactions in the active site, in particular between amino acid F87 and the aromatic substrates. Substituting phenylalanine by the 19 other canonical amino acids led to loss of efficient aromatic hydroxylation of p-xylene indicating that aromatic interactions are indispensable for this substrate class. Systematic investigations of a number of benzenes derivates supported the hypothesis that regioselectivity and activity is governed strongly by pi-pi-interactions of substrate and protein. Introducing a phenylalanine at position 330, in close distance to the active site, further increased the binding and activity of P450 BM3 for substrates such as pseudocumene, mesitylene and nitrotoluene. Overall the measurements were in good agreement with the docking of substrates and proposed a T-shape orientation of the substrates in the binding pocket of P450 BM3. In the last part of this thesis the development of two novel methods for directed protein evolution, OmniChange and PTRec are described. OmniChange allows for the first time the efficient and reliable saturation of five independent codons in a DNA sequence, addressing current challenges and demands in focused mutagenesis. An in-depth statistical analysis of 48 clones showed that up to 86% of all theoretical codons were present at five simultaneously targeted positions. The robust and simple protocol allows a modular and combinatorial assembly of the targeted codons to study additive and cooperative effects in detail. Based on the successful OmniChange protocol a new method for DNA recombination, named ‘PTRec’, was established. PTRec enables recombination of proteins with less than 50% sequence identity and requires only four conserved amino acids to design a crossover point. As proof of principle a model library of three phytase gene sequences was generated. The chimeras were sequenced and the distribution of specific domains revealed a close to ideal statistical distribution of DNA fragments. OmniChange and PTRec are based on phosphorothioate chemistry and allow for the first time a simple and robust fusion of multiple DNA fragments having low restrictions with regard to DNA sequence homology. In both cases the E. coli host was able to uptake and repair multiple DNA nicks to fuse up to five DNA fragments. If successfully accomplished, the protocol could be extended do develop further methods that would fuel progress in the engineering of proteins and in the implementation of biocatalyst into sustainable chemo-synthetic processes.

Die biokatalytische Produktion von Fein- und Bulk-Chemikalien ist von wachsender Bedeutung für die Entwicklung nachhaltiger Synthesewege. P450 Monooxygenasen spielen eine Schlüsselrolle in der selektiven Funktionalisierung von nicht-aktivierten C-Atomen mit Luftsauerstoff, eine der Hauptherausforderungen in der organischen Synthese. Insbesondere die industrielle Synthese von Phenol, unter Verwendung von Benzol als Startmaterial, ist ineffizient und nur durch den hohen Bedarf des Nebenproduktes Aceton profitabel. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Entwicklung von Varianten der bakteriellen P450 Monooxygenase BM3 aus Bacillus megaterium zur Anwendung in der Synthese von Phenolen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer effizienten P450 Monooxygenase für die Produktion industriell bedeutender o-Phenole, die als Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika, Plastik oder Vitaminen verwendet werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden P450 BM3 Varianten identifiziert, welche eine verbesserte Aktivität für Benzolsubstrate aufweisen, sowie eine effizientere Nutzung des NADPH Co-Faktors und ein breiteres Substratspektrum. Dreißig potentielle Substrate wurden mit der Variante M2 (R47S, Y51W, I401M) untersucht und die Umsetzung von 12 Benzolen im Detail charakterisiert. Insbesondere die Hydroxylierung von Anisol mit Variante M3 (R47S, Y51W, A330F, I401M) war besonders effizient (>95% Selektivität o-Position), wobei eine finale Produktkonzentration von mehr als einem 1 g/L erreicht wurde. Neben dem breiterem Substratspektrum und der Entwicklung eines Protokolls für die semi-präparative Synthese der entsprechenden Phenole, wurde der Einfluss von weitläufig verwendeten Lösungsvermittlern wie DMSO auf die aromatische Hydroxylierung von Toluol untersucht. Die effizienteste Produktion von o-Kresol war möglich ohne den Einsatz von zusätzlichen Lösungsvermittlern, was eine kostengünstigere Synthese und vereinfachte Produktaufreinigung erlaubt. Die katalytische Charakterisierung der entsprechenden P450 BM3 Varianten wurde durch Substrat-Docking Studien zur Aufklärung der Selektivitäten ergänzt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die aromatische Hydroxylierung von Benzolen durch Wechselwirkungen mit Phenylalanine 87 im aktiven Zentrum von P450 BM3 dirigiert wird. Der Austausch von F87 gegen alle 19 kanonischen Aminosäuren führt zu einem Verlust der Fähigkeit von P450 BM3 zur effizienten aromatischen Hydroxylierung von p-Xylol. Daraus lässt sich erschließen, dass die Aminosäure F87 essentiell für die aromatische Hydroxylierung von Benzolen durch P450 BM3 ist. Die systematische Untersuchung ausgewählter Substrate unterstützt die Hypothese, dass sowohl Regioselektivität als auch Aktivität insbesondere durch pi-pi-Wechselwirkungen zwischen Protein und Benzol-Substraten gesteuert wird. Der Austausch von Alanin gegen Phenylalanin an Position 330, nahe am aktiven Zentrum von P450 BM3, erlaubt eine stärkere Bindung und bis zu 49-fach erhöhte Aktivität für Mesitylen. Katalytische Daten und Docking Ergebnisse weisen in beiden Untersuchungen auf eine T-förmige Bindung der Benzole im aktiven Zentrum von P450 BM3 hin. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung von zwei neuartigen Methoden für die Gelenkte Evolution von Biokatalysatoren beschrieben, OmniChange und PTRec. OmniChange ermöglicht zum ersten Mal die effiziente und zuverlässige Saturierung von bis zu fünf unabhängigen Aminosäuren innerhalb einer DNA Sequenz, wobei die aktuellen Anforderungen in der fokussierten Mutagenese erfüllt werden. Die detaillierte Analyse von 48 sequenzierten Klonen hat gezeigt, dass bis zu 84% aller möglichen Codons an den ausgewählten Positionen eingebaut wurden. Ein einfaches und robustes Protokoll erlaubt insbesondere die Untersuchung kooperativer Effekte in Proteinstrukturen. Basierend auf dem OmniChange Protokoll wurde die PTRec Methode zur Rekombination von Proteinen mit weniger als 50% Sequenzidentität entwickelt. Beispielhaft wurde eine Modellbibliothek bestehend aus drei Phytase-Sequenzen generiert. Die Chimären wurden sequenziert und die Verteilung der spezifischen Domänen untersucht. Hierbei konnte eine nahezu statistisch ideale Verteilung der spezifischen Domänen festgestellt werden. OmniChange und PTRec basieren auf der Verwendung phosphoro-thiolierter Nukleotide, welche eine robuste und nahezu sequenzunabhängige Assemblierung von bis zu fünf DNA Fragmenten ermöglichen. In beiden Fällen war E. coli in der Lage die assemblierten, nicht-ligierten Plasmide aufzunehmen und als funktionelle Plasmide zu replizieren, wobei die 10 DNA-nicks kein Problem darstellten. Anhand der beiden entwickelten Methoden können einzigartige Biokatalysatoren für spezifische Anwendungen wie z.B. für biokatalytische Prozesse maßgeschneidert werden.

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