Entwicklung von Pflanzenzellkulturen im Hinblick auf die industrielle Produktion biopharmazeutischer Wirkstoffe

Holland, Tanja; Fischer, Rainer

doi:32710

Entwicklung von Pflanzenzellkulturen im Hinblick auf die industrielle Produktion biopharmazeutischer Wirkstoffe = Development of plant suspension cultures with regard to industrial production of biopharmaceuticals

Holland, Tanja

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Tanja Holland

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangII, 131 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-11-11

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-48298
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/229173/files/4829.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pflanzenzelle (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Biologika (Genormte SW) ; Naturwissenschaften (frei) ; Pflanzenzellkultur (frei) ; DoE (frei) ; Medienentwicklung (frei) ; Up-stream-Prozessing (frei) ; plant cell cultures (frei) ; Design of Experiments (DoE) (frei) ; medium development (frei) ; medium optimization (frei) ; up-stream processing (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 500

Kurzfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Produktion des humanen monoklonalen Anti-HIV-Antikörper 2G12 in Nicotiana tabacum L. cv. BY-2 Zellkulturen optimiert. Zur Produktion des Antikörpers wurden zwei Zelllinien eingesetzt, die Zelllinie GFD, bei der der Antikörper in den Apoplasten sekretiert wurde, und die Zelllinie GFERD, bei der mittels Retentionssignal (SEKDEL) die Lokalisation im endoplasmatischen Retikulum erreicht wurde. Die wesentlichen Themengebiete, die innerhalb dieser Arbeit bearbeitet wurden, waren die Analyse und Charakterisierung der Zelllinien, die Entwicklung eines Produktionsmediums inklusive Modellbildung mit Hilfe statistischer Versuchsplanung und die Prozessentwicklung. Im ersten Schritt wurde die Selektion stabil transgener BY-2 Zelllinien untersucht und festgestellt, dass das Reporterprotein DsRed als erster Selektionsschritt effizient eingesetzt werden kann, dass jedoch eine anschliessende Bewertung der Produktivität der Zelllinien unter Produktionsbedingungen erfolgen sollte. Für die Zelllinie GFD#5 konnte nachgewiesen werden, dass es sich um eine heterogene, d.h. oligoklonale Zelllinie handelte, bei der eine Monoklonalisierung zur Steigerung der Expression sinnvoll wäre. Außerdem konnte eine Promotormethylierung, die vermutlich aufgrund eines Stressimpulses zustande kam, durch die Zugabe von Aza-Cytidin erfolgreich wieder aufgehoben werden. Durch die Medien-optimierung konnte ein neues Pflanzenzell-Produktionsmedium entwickelt werden, das sowohl im Schüttelkolben als auch im Fermenter zu einer Ausbeutesteigerung bei beiden Zelllinien führte: Zelllinie GFD#5, sekretierter mAK 2G12• 20-fach höhere Konzentration im Vergleich zum Standard MS-Medium • 2-fach höhere Konzentration im Vergleich zum bereits optimierten MSN-Medium• Keine Beeinträchtigung der Qualität:hohe Aktivität, homogenes N Glykan-MusterZelllinie GFERD#17, ER-retardierter mAK 2G12• 2,6-fach höhere volumetrische Ausbeute im Vergleich zum MS-Medium• Keine Beeinträchtigung der Qualität:hohe Aktivität, homogenes N Glykan-MusterDurch den Einsatz von statistischer Versuchsplanung konnten zusätzlich mathematische Modelle für die extrazelluläre 2G12-Akkumulation und die Zellbiomasse erstellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Process Analytivcal Technologies (PAT) Initiative durch den Einsatz einer dielektrischer Spektroskopie zur online Biomassemessung erfolgreich für BY-2-Processe implementiert. Es konnten zusätzlich lineare Zusammenhänge zwischen den konventionellen offline Wachstumsparametern, wie dem Frischgewicht, dem Trockengewicht und dem PCV, erstellt und entsprechende Umrechungsfaktoren aufgestellt werden. Durch den Einsatz einer fed-batch Strategie mit einem gemischten Feed aus Saccharose und Kaliumnitrat konnte die Produktionsphase von der Wachstumsphase entkoppelt werden.

In the present work the production of the human monoclonal Anti-HIV Antibody 2G12 in Nicotiana tabacum L. cv. BY-2 cell cultures has been optimised. Two independent cell lines have been used. The antibody produced from the cell line GFD was secreted into the apoplast, whereas the antibody produced from the cell line GFERD was localized in the endoplasmic reticulum. The main topics studied in this work were the analysis and characterisation of the cell lines, the development of a production medium by design of experiments, the modulation of the antibody production with mathematic modells and the process development and optimisation. In the first part the method for the selection of stable transgenic cell lines was investigated in more detail. The results showed that the the reporter protein DsRed can be used initially for identifying promising cell lines, however, a subsequent screening under production conditions should be done. The analysis of the cell line GFD#5 showed that this line was heterogeneous, i.e. oligoclonal, and that monoclonalization would be important to further increase the production yields. During the work, the cell line showed a drop in productivity, probably resulting from a stress response. The reduction of expression was epigenetic due to promoter methylation because productivity has been restored after cultivating exponentially growing cells in the presence of aza-cytidine. A new production medium called MSNP for Nicotiana tabacum L. cv. BY-2 cell cultures have been developed. The use of this medium led to an increase of the antibody yields in shaking flask as well as in bioreactor experiments: Cell line GFD#5, secreted mAb 2G12• 20-x higher concentration compared to the standard MS-medium • 2-x higher concentration compared to the already optimised MSN-Medium• No impact on the product quality: high activity, homogeneous N glycan-patternCell line GFERD#17, ER-retarded mAb 2G12• 2,6-x higher volumentic product yield compared to the standard MS-Medium• No impact on the product quality: high activity, homogeneous N glycan-patternFurthermore the use of design of experiments enabled the generation of mathematic models for predicting the extracellular 2G12-concentration and the ceell biomass. Process analytical technologies (PAT) have successfully been implemented within this work for Nicotiana tabacum L. cv. BY 2 suspension cell cultures. Dielectric spectroscopy was established as an inline biomass measurement and linear correlations between the conventional offline parameters such as the packed cell volume, the fresh weight and the dry weight and the corresponding conversation factor have been determined.The use of a fed-batch strategy with a mixed feed of sucrose and potassium nitrate enabled the successful uncoupling of the growth and production phase.

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