Optimization of cellulase CelA2 with improved performance in high ionic strength for the production of biofuels

Lehmann, Christian; Schwaneberg, Ulrich

doi:32612

Optimization of cellulase CelA2 with improved performance in high ionic strength for the production of biofuels = Optimierung der katalytischen Eigenschaften der Cellulase CelA2 in hoher Ionenstärke für die Produktion von Biokraftstoffen

Lehmann, Christian

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Christian Lehmann

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangVII, 104 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-07-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-47184
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/230127/files/4718.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Proteindesign (Genormte SW) ; Cellulasen (Genormte SW) ; Biokraftstoff (Genormte SW) ; Meerwasser (Genormte SW) ; Cellulose (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Ionische Flüssigkeiten (frei) ; tief eutektische Lösungsmittel (frei) ; Ionic liquid (frei) ; deep eutectic solvent (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Begrenzte Vorkommen an fossilen Brennstoffen und die ökologischen Auswirkungen durch die CO2 Emission sind die Hauptgründe für die Entwicklung von alternativen Kraftstoffen, welche auf erneuerbaren biologischen Ressourcen basieren sollen. Ein wichtiger Schritt in der Produktion von Biokraftstoffen ist die chemo-enzymatische Depolymerization von Cellulose zu fermentierbaren Zuckern unter milden Reaktionsbedingungen. Zunächst ist ein physikalisch-chemischer Vorbehandlungsschritt erforderlich, um die Löslichkeit der Cellulose vor dem darauffolgenden enzymatischen Abbau zu erhöhen. Durch Verwendung von ionischen Flüssigkeiten (IL) konnte die Kristallinität der Cellulose verringert und somit die Zugänglichkeit der Cellulose für einen enzymatischen Abbau erhöht werden. Die erste Generation ionischer Flüssigkeiten jedoch war teuer, nicht biologisch abbaubar und/oder hatte einen hohen ökologischen Faktor, weshalb in letzter Zeit tief-eutektische Lösungsmittel (DES) als Alternative zu ILs verwendet wurden. DES zeichnen sich durch ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften wie ILs aus, jedoch mit dem entscheidenden Vorteil nicht nur biologisch abbaubar, sondern auch kostengünstig zu sein. Darüber hinaus kann die Wirtschaftlichkeit des Bioraffinerie-Prozesses der Cellulose verbessert werden, indem nicht gereinigte Abwässer im Vorbehandlungsschritt zum Einsatz kommen (z.B. konzentriertes Meerwasser). Unabhängig vom eingesetzten Salz (z.B. von Meerwasser, ILs oder DES), ist es eine Herausforderung Cellulasen zu finden, die auch unter hohen Salzkonzentrationen effizient funktionieren. Die Cellulase CelA2 wurde aus einer Metagenom-Bibliothek, die ihren Ursprung in einer Biogasanlage hat, isoliert und zeigte eine erfolgversprechende Endoglukanase-Aktivität in ILs. Deshalb wurde die Cellulase CelA2 als ein geeigneter Kandidat für weitere Verbesserungen, hinsichtlich der Resistenz und Aktivität in salzhaltigen Flüssigkeiten, für eine gerichtete Evolutionsstudie ausgewählt. Für die gerichtete Evolution von Cellulasen wurde ein neuartiges Fluoreszenz-basierendes Mikrotiterplatten Durchmusterungssystem entwickelt. In der generierten Zufallsmutagenese-Bibliothek (error prone PCR) wurden CelA2 Varianten mit verbesserten Eigenschaften gefunden. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass die Aminosäure 288 eine Schlüsselposition für gesteigerte Resistenz bzw. spezifische Aktivität einnimmt. In einer anschließend durchgeführten gerichteten Evolutionsstudie wurde eine neuartige CelA2 Variante identifiziert, die im Vergleich zum Wildtyp in Puffer eine kaum messbare Aktivität aufweist. Durch Zugabe von IL, DES oder NaCl wurde die Aktivität erheblich gesteigert. Basierend auf „Molecular Dynamics“ Analysen konnte eine Hypothese für den Salz-Aktivierungsmechanismus postuliert werden. Es wurde eine neuartige Methode für die gerichtete Evolution etabliert, welche die klassische MEGAWHOP Strategie durch die zufällige Einführung von Mutationen in den gewünschten Expressionsvektor (epMEGAWHOP) invertiert. Diese Methode ist eine schnelle und zielgerichtete Alternative zur Erhöhung der Proteinexpression unabhängig von Enzymklasse oder Expressionsvektor.

Limited reserves of fossil fuels and environmental impact on CO2 emissions motivate the research and development of fuel alternatives produced from renewable bioresources. A key-step in biofuel production is the chemo-enzymatic depolymerization of cellulose in order to release fermentable sugars under mild conditions. However, physico-chemical pretreatments must be applied to increase the solubility of cellulose prior to enzyme degradation. The use of ionic liquids (IL) was reported to decrease the cellulose crystallinity thus increasing the availability of cellulose for enzymatic degradation. First generation of ionic liquids were expensive, not biodegradable and/or have a high environmental factor, thus deep eutectic solvents (DES) have emerged as an alternative solvent to ILs. DES show similar properties as ILs, with the advantage of being biodegradable and cost-effective. Furthermore, process economics can be improved by using non-purified effluents (e.g. concentrated seawater) for pretreatment in biorefineries. Regardless of the salts used (e.g. from seawater, ILs, or DES) it is challenging to find cellulases that operate efficiently under high salt conditions. Cellulase CelA2 was isolated from a biogas plant metagenome library and revealed an outstanding endoglucanase performance in ionic liquids. Therefore CelA2 was chosen as a suitable candidate for further improving the resistance and activity in salty effluents by a directed evolution campaign. For directed cellulase evolution, a novel fluorescence based microtiter plate screening system was developed. CelA2 variants with improved performance were identified from random mutagenesis libraries (epPCR), and further analysis showed that amino acid position 288 was the key residue for increased resistance and specific activity. In a subsequent directed evolution campaign, a novel CelA2 variant was identified, which showed a marginal activity compared to wild type, which dramatically increased by adding IL, DES or NaCl. Based on Molecular Dynamics analysis a potential mechanism for this salt-activation was proposed. Furthermore, a novel method for directed evolution was established, which inverts the classic MEGAWHOP strategy by introducing random mutations in the desired expression vector (epMEGAWHOP). This method can be used as a rapid and straightforward alternative for increasing protein expression in iterative rounds of epMEGAWHOP which is not limited by the enzyme type or expression vector.

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