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000444861 1001_ $$0P:(DE-82)090110$$aBracco, Paula$$b0$$eAuthor
000444861 245__ $$aSelective steroid hydroxylation by bacterial cytochrome P450 monooxygenases$$cvorgelegt von Maria Paula Bracco Garcia$$honline, print
000444861 246_3 $$aSelektive Steroidhydroxylierung durch bakterielle Cytochrom P450 Monooxygenasen$$yGerman
000444861 260__ $$aAachen$$c2014
000444861 300__ $$aVII, 263 S. : Ill., graph. Darst.
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000444861 520__ $$aRegio- and stereoselective hydroxylation of steroid molecules remains a challenge in industrial steroid hormone synthesis. Here, the use of cytochrome P450 monooxygenases is of high interest due to their remarkable ability to catalyze the direct hydroxylation of non-activated carbon atoms in a regio- and stereoselective manner. This allows also the selective oxyfunctionalization of steroids, thus avoiding the use of protecting groups and several time-consuming chemical steps. In this thesis, the use of bacterial P450s, especially CYP154C5 from Nocardia farcinica, was investigated for the selective hydroxylation of various steroids. In particular, an efficient whole-cell biocatalyst was developed based on the recombinant expression of CYP154C5 in Escherichia coli together with putidaredoxin and putidaredoxin reductase from Pseudomonas putida for electron transfer. Cofactor regeneration was achieved by the simple addition of glucose and with the help of hydroxypropyl-beta-cyclodextrin for substrate solubilization, several steroid molecules could be successfully converted with up to 15 mM initial steroid concentration using this whole-cell system. Additionally, 16alpha-hydroxylated steroids, which are important precursors for the synthesis of highly potent glucocorticoids, were selectively produced on preparative scale with total turnover numbers (TTN, µmol substrate consumed µmol-1 CYP154C5) exceeding 2000 and space-time yields of several grams per liter a day. Furthermore, CYP154C5´s crystal structure with six different steroid substrates bound in the active site was determined to identify key residues in the active site that are involved in substrate binding and therefore responsible for the remarkable selectivity of the P450 monooxygenase. Among the 21 residues forming the active site, four were suspected to play an important role in substrate binding and catalytic activity. In particular, residues M84 and F92 were identified to be involved in hydrophobic interactions with the steroid core, whereas residues Q239 and Q398 were found to form hydrogen bonds with oxyfunctional groups at positions C3 and C17 of the steroid substrate. Two strategies were applied to further investigate the selectivity of CYP154C5. Firstly, the four mentioned residues were exchanged by alanine through site-directed mutagenesis in order to remove the mentioned enzyme-substrate interactions. The resulting mutants were analyzed in the conversion of six steroid substrates by determining dissociation constants (KD), turnover numbers (TON), TTN and coupling efficiencies using purified proteins. Results confirmed the importance of the four residues for substrate binding and conversions as indicated by the decreased substrate affinity and overall efficiency of the conversion. As the only exception, nandrolone was found to be better converted by mutant Q239A as compared to wild-type CYP154C5. Interestingly, with a single mutation in the active site a secondary hydroxylation product was obtained in the conversion of progesterone by CYP154C5-F92A, thus changing the regioselectivity of this enzyme. In a second approach, CYP154C5 wild type was tested in the conversion of selected steroids lacking key functional groups in their structure that could substantially affect substrate binding and therefore also  selectivity of the enzyme. Interestingly, here the regioselectivity of CYP154C5 was altered when a steroid lacking a functional group at position C17 was used as substrate as indicated by the formation of the 15alpha- instead of 16-hydroxylated product. Furthermore, the use of a steroid substrate bearing no functional group at C3 also resulted in a changed regioselectivity of CYP154C5 as here four different hydroxylation products were obtained. In contrast, steroid substrates with large substituents at position C17 were not converted by the P450. These findings shed light on the possibility to create a CYP154C5-based tool box for selective steroid hydroxylation by protein engineering. Interestingly, a much smaller substrate, beta-ionone, was also selectively monohydroxylated by this enzyme. CYPs from other bacterial sources were also tested in steroid conversions within this thesis. As novelty, we could show for the first time that also 3beta-hydroxy-Delta5-steroids are hydroxylated by CYP106A2 from Bacillus megaterium in a regioselective manner. Furthermore, CYP110D1 from Nostoc sp. was shown for the first time to hydroxylate also other steroid molecules than testosterone. In summary, industrially important target positions for steroid hydroxylation such as 7alpha-, 7beta-, 11-, 15alpha- and 16alpha- were successfully hydroxylated within this thesis by the use of different bacterial P450 enzymes and the enzymes’ selectivities varied depending of the applied substrates.$$leng
000444861 5203_ $$aDie regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Steroiden stellt eine große Herausforderung in der industriellen Steroidhormonsynthese dar. In diesem Zusammenhang ist der Einsatz von Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) von besonderem Interesse, da sie in der Lage sind, nicht-aktivierte Kohlenwasserstoffe regio- und stereoselektiv zu hydroxylieren. Zudem können sie zur selektiven Oxyfunktionalisierung von Steroiden eingesetzt werden, was zur deutlichen Vereinfachung aufwendiger Mehrschrittsynthesen beitragen kann. In dieser Arbeit wurde die Anwendung bakterieller P450 Monooxygenasen, vor allem von CYP154C5 aus Nocardia farcinica, für die selektive Hydroxylierung ausgewählter Steroide untersucht. Dazu wurde zunächst ein effizienter Ganzzellkatalysator basierend auf der heterologen Expression von CYP154C5 in Escherichia coli zusammen mit den Redoxpartnern Putidaredoxin und Putidaredoxinreduktase aus Pseudomonas putida entwickelt. Regenerierung des Cofaktors NADH im Ganzzellsystem wurde durch einfache Zugabe von Glucose erzielt, während die Löslichkeit der Steroidsubstrate durch Einsatz von Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin erhöht werden konnte. Das entwickelte Ganzzellsystem erlaubte die effiziente Umsetzung verschiedener Steroide selbst bei Anfangssteroidkonzentration von bis zu 15 mM. Zudem wurden ausschließlich 16alpha-hydroxylierte Steroide, welche wichtige Ausgangsstoffe für die Synthese von Glucokortikoiden darstellen, produziert. Im präparativen Maßstab wurden dabei total turnover numbers (TTN, µmol verbrauchtes Substrat µmol-1 CYP154C5) von über 2000 und Raum-Zeit-Ausbeuten von bis zu 4 Gram pro Liter pro Tag erzielt. Desweiteren wurden Kristallstrukturen von CYP154C5 mit sechs verschiedenen Steroidliganden gelöst, um die molekularen Gründe der hohen regio- bzw. Stereoselektivität dieser P450 Monooxygenase genauer zu verstehen. Vier der 21 Aminosäuren (M84, F92, Q239, Q398) im aktiven Zentrum des Enzyms spielen dabei eine besondere Rolle für Substratbindung sowie die katalytische Aktivität von CYP154C5. Insbesondere die Aminosäuren M84 und F92 weisen hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Steroidgrundgerüst auf, während Q239 und Q398 Wasserstoffbrücken zu funktionellen Gruppen an Position C3 und C17 des Steroids ausbilden. Um die Selektivität von CYP154C5 genauer zu untersuchen, wurden zwei verschiedene Strategien verfolgt. Zum einen wurden die vier genannten Aminosäuren durch Mutagenese gegen Alanin ausgetauscht, um somit die jeweilige Interaktion zwischen Enzym und Substrat zu unterbinden. Die  resultierenden Mutanten wurden anschließend in Biokatalysen charakterisiert und Dissoziationskonstanten (KD), Umsatzraten, TTN und Kopplungseffizienzen bestimmt. Die dabei erhaltenen verminderten Substrataffinitäten und katalytischen Effizienzen der Mutanten beweisen, dass M84, F92, Q239 und Q398 eine wichtige Rolle für Substratbindung und -umsatz spielen. Lediglich für Mutante Q239A wurde ein deutlich höherer Umsatz von Nandrolone als für CYP154C5 WT erhalten. Interessanterweise wies Mutante F92A die Bildung eines zweiten Produktes in der Umsetzung von Progesteron auf, was auf eine veränderte Regioselektivität des Enzyms schließen lässt. Als zweite Strategie zur genaueren Untersuchung der Selektivität von CYP154C5 wurden Biokatalysen mit Steroiden durchgeführt, denen spezifische funktionelle Gruppen zur Interaktionen mit Aminosäureseitenketten des Enzyms fehlen. Dabei wurde 5alpha-androstan-3-one, ein Steroidsubstrat ohne funktionelle Gruppe an C17 nicht mehr in 16alpha, sondern 15alpha;-Position hydroxyliert. Auch das Fehlen einer funktionellen Gruppe an Position C3 des Steroids 3-Deoxydehydropeiandrosterone resultierte in einer veränderten Regioselektivität, da hier vier unterschiedliche Hydroxylierungsprodukte erhalten wurden. Im Gegensatz dazu wurden Steroide mit großen Substituenten an Position C17 nicht umgesetzt. Basierend auf den Ergebnissen können in Zukunft gezielt CYP154C5-Varianten mit unterschiedlicher Regio- und Stereoselektivität für die gezielte Hydroxylierung von Steroiden generiert werden. Darüber hinaus wurden in der vorliegenden Arbeit weitere bakterielle CYPs für Steroidumsetzungen untersucht. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass auch 3beta-Hydroxy-Delta5-steroide mittels CYP106A2 aus Bacillus megaterium selektiv hydroxyliert werden können. Zudem konnten neben Testosteron weitere Steroidsubstrate für CYP110D1 aus Nostoc sp. identifiziert werden. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit somit industriell bedeutende Positionen für Steroidhydroxylierungen wie 7alpha, 7beta, 11, 15alpha and 16alpha durch Einsatz verschiedener bakterieller CYPs selektiv hydroxyliert werden. Die erzielten Selektivitäten der Enzyme variierten dabei in Abhängigkeit von den eingesetzten Steroidsubstraten.$$lger
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