Funktionelle Kooperation der Transmembransegmente S3 und S4 beim Schaltverhalten von TRPM8

Winking, Mathis; Kühn, Frank J. P.; Spehr, Marc

doi:5338

Funktionelle Kooperation der Transmembransegmente S3 und S4 beim Schaltverhalten von TRPM8 = Functional cooperation between the transmembrane segments S3 and S4 during the gating-process of TRPM8

Winking, Mathis

2015

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Mathis Winking

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2015

Umfang114 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Kühn, Frank J. P. (Thesis advisor) ; Spehr, Marc (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-11-28

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-53389
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/463095/files/5338.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/463095/files/5338.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Spannungskontrollierter Ionenkanal (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Spannungssensor (frei) ; Icilin (frei) ; Ladungsumkehrmutation (frei) ; TRP-Kanal (frei) ; N-Glykosylierung (frei) ; voltage-sensor (frei) ; N-glycosylation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
TRP-Kanäle sind polymodale Rezeptoren, die an vielen physiologischen Prozessen maßgeblich beteiligt sind. Bei TRPM8 handelt es sich um einen Kältesensor, der ebenfalls durch Substanzen, die ein Kältegefühl vermitteln, wie beispielsweise Menthol aktiviert wird. Darüber hinaus ist der TRPM8-Kanal spannungsabhängig, wobei die Spannungssensitivität sowohl durch Kälte als auch durch verschiedene TRPM8-Kanalagonisten positiv moduliert wird. Im Gegensatz zu den gut erforschten „klassischen“ spannungsabhängigen Kationenkanälen gibt es bisher für TRPM8 kein allgemein akzeptiertes Modell, welches im Detail den Gating-Mechanismus beschreibt. In Anlehnung an ein Computermodell zum Schaltverhalten von TRPM8 wurden in der vorliegenden Arbeit durch Einführung gezielter Mutationen in den Transmembrandomänen S3 und der für die Spannungssensitivität wichtigen S4 mögliche funktionelle Wechselwirkungen zwischen diesen Domänen systematisch analysiert. Zusätzlich erfolgte eine Analyse der strukturellen und funktionellen Bedeutung der S3 und S4 für das Schaltverhalten und die Faltung von TRPM8. In der vorliegenden Arbeit konnte der Nachweis einer funktionellen Kooperation zwischen den Transmembransegmenten S3 und S4 bei TRPM8 erbracht werden. Die Ladungsverteilung im zentralen Bereich dieser Proteindomänen spielt eine entscheidende Rolle für die korrekte Faltung bzw. für die posttranslationale Reifung (Glykosylierung) des Kanals und ist zusätzlich von funktioneller Bedeutung. Das innerhalb der S3 gelegene hochkonservierte Sequenzmotiv N-x-x-D ist darüber hinaus nicht nur für TRPM8 sondern auch für den Verwandten TRPM2-Kanal von funktioneller Relevanz. Des Weiteren konnten durch systematische Ladungsveränderungen im Transmembransegment S4 von TRPM8 neue Erkenntnisse im Bezug auf die Spannungsabhängigkeit von TRPM8 gewonnen werden, die das bislang favorisierte Modell eines autonomen mobilen S4-Spannungssensors bei TRPM8 in Frage stellen. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf eine, von S3 und S4 gemeinsam gebildete, Proteindomäne bei TRPM8 hin. Diese dient u.a. der Interaktion des Kanals mit verschiedenen TRPM8-Agonisten und ist darüber hinaus für die Spannungssensitivität des Kanals von entscheidender Bedeutung, möglicherweise durch eine Wechselwirkung mit dem negativ geladene Phospholipid PIP2.

TRP channels are polymodal receptors that are involved in many substantial physiological processes. TRPM8 is a sensor for cold temperatures, but can additionally be activated by substances that mediate a cold feeling such as menthol. Furthermore, the TRPM8 channel is voltage-dependent, whereby the voltage sensitivity can be positively modulated both by, cold as well as by various TRPM8 channel agonist. In contrast to the well studied "classical" voltage-dependent cation channels, there is no generally accepted model for TRPM8, which describes the gating mechanism in detail so far. Based on a recently published computer simulated model for TRPM8 gating, we used site directed mutagenesis to systematically analyze potential interactions between transmembrane domain S3 and S4, which has been demonstrated to be essential for voltage sensitivity. Furthermore, the structural and functional importance of S3 and S4 for gating and folding of TRPM8 was analyzed. In the present work, the evidence of a functional cooperation between the transmembrane segment S3 and S4 in TRPM8 was proofed. The charge distribution in the central region of these protein domains plays a crucial role for a proper folding and for posttranslational maturation (glycosylation) of the channel and therefor is essential for its functionality. Furthermore, the highly conserved sequence motif N-x-x-D located in S3, is not only for TRPM8 but also for the closely related TRPM2 channel of functional relevance. In addition, new insights could be gained about the voltage dependence of TRPM8 by systematic changes of charged amino acids within the S4 segment, which question the so far favored model of an autonomous mobile S4 voltage sensor in TRPM8. Taken together, the results of this study indicate a protein domain corporately formed by S3 and S4 in TRPM8. This domain conduces i.a. the interaction of the channel with different TRPM8 agonists and additionally is of crucial importance for the voltage sensitivity of the channel, possibly through an interaction with the negatively charged phospholipid PIP2.

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