Development of a cystatin C-specific bioassay for integration into an implantable biochip system

Damm, Tatjana; Fischer, Rainer; Barth, Stefan

doi:34871

Development of a cystatin C-specific bioassay for integration into an implantable biochip system

Damm, Tatjana

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologin Tatjana Damm (geb. Feller) aus Alma-Ata (Kasachstan)

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (VIII, 107 Blätter) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2014

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor) ; Barth, Stefan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-12-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-010367
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/463807/files/463807.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/463807/files/463807.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Interesse an diagnostischen Biochips wächst. Nichtsdestotrotz sind die meisten Biochips für ex vivo Anwendungen konzipiert. Darüber hinaus korreliert eine erhöhte Konzentration an humanem Cystatin C (hCC) im Serum mit verschiedenen Erkrankungen. Daher wurde hCC als Biomarker vorgeschlagen. Um die Voraussetzungen für einen implantierbaren Biochip zu erfüllen ist die Entwicklung eines hCC-spezifischen Bioassays, der repetitive Messungen erlaubt, zwingend notwendig. In dieser Doktorarbeit wurde ein hCC-spezifischer Bioassay entwickelt, der auf der konzentrationsabhängigen Verdrängung zwischen hCC und einem hCC-Fusionsprotein auf einer hCC-spezifischen Antikörperschicht beruht. Dafür wurden hCC, hCC-Fusionsproteine und Glutathion STransferase (GST) erfolgreich kloniert, produziert und gereinigt. Zur Immunisierung von Mäusen wurde das Fusionsprotein stGST-hCC verwendet, wodurch eine hCCspezifische Immunantwort induziert wurde. Unter Verwendung der Hybridoma Technologie wurden monoklonale Hybridoma Zelllinien etabliert, die die Selektion und Produktion von monoklonalen Antikörpern (mAk) ermöglichten. Die Selektion entsprechender monoklonaler Hybridoma Zelllinien führte unter Verwendung von indirektem ELISA, „sandwich“ ELISA und der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) -Spektroskopie zum Erfolg. Ausgewählte monoklonale Hybridoma Zelllinien wurden für die Produktion von hCCspezifischen mAk genutzt. Die Antikörper wurden ohne Reinigungsschritt auf Basis ihrer hCC Assoziations- und Dissoziationscharakteristika mit der SPR-Spektroskopie analysiert. Von ursprünglich 12 potentiellen mAk wurden 5 identifiziert, die spezifische und unterschiedliche hCC Assoziations- und Dissoziationscharakteristika aufwiesen. Für den Verdrängungsassay waren die Dissoziationscharakteristika von besonderem Interesse und wurden daher als Basis für die Einordnung der mAk genutzt. Während mAk CyDI-1 keine und CyDI-12 fast keine Dissoziation aufwiesen, war diese für mAk CyDI-2, CyDI-4 klar erkennbar und für mAk CyDI-3 am größten. Die fünf entsprechenden Hybridoma Zelllinien wurden für Produktion der mAk im großem Maßstab genutzt, wobei alle Zelllinien mAk des Isotyps IgG1:κ produzierten. Alle mAk wurden mit der Protein-G Affinitätschromatographie gereinigt. Abhängig von ihrer Verfügbarkeit wurden mAk CyDI-1, CyDI-2 und CyDI-4 weiter mit der SPR- Spektroskopie analysiert. Dieses Mal wurden neben hCC, hCC-Fusionsproteine eingesetzt um eine geeignete Kombination für den Verdrängungsassay zu identifizieren. Der mAb CyDI-4 wurde als Antikörper mit dem höchstem Potential zur Ermöglichung einer Verdrängung gefunden. Mit Ausnahme vom verbesserten grün fluoreszierenden Protein (GFP)-hCC, zeigten alle Fusionsproteine und hCC die gleichen Assoziations- und Dissoziationscharakteristika in der SPR-Spektroskopie. Die Kombination aus stGST-hCC wurde als beste Kombination für die Endanwendung gefunden. Dennoch war die Evaluation dieser Kombination in der Endanwendung bis zum Ende dieser Arbeit nicht möglich. Parallel zu der Evolution des Chips wurde ein Fluoreszenz-basierter Assay etabliert, der die Evaluation der Verdrängungsmöglichkeit auf mAb CyDI-4 ermöglichte. Dadurch wurde die Unterscheidung von hCC und einem hCCFusionsproteins ermöglicht ohne die Modifikation der Antigene und ohne die Verwendung von Sekundärantikörpern, was unverzichtbar war da Modifikationen die Affinität ändern können und Sekundärantikörper nicht in dem finalen Bioassays vorgesehen sind. Mit der Kombination aus mAb CyDI-4, hCC und GFP-hCC wurde ein Fluoreszenzbasierter Verdrängungsassay entwickelt, der die Voraussetzungen für ein Implantat im Hinblick auf Zeitdauer, Kompatibilität mit humanem Serum und Sensitivität für physiologische und die meisten pathologischen Zustände erfüllt. Zusätzlich sank der Standardfehler unter Verwendung von Serum während die Sensitivität erhalten blieb. Nichtsdestotrotz hat der Verdrängungsassay gezeigt, dass bei der Verdrängung eine Seite leicht bevorzugt wird, was durch die SPR-Spektroskopie für hCC und GFP-hCC vorhergesagt wurde. Obwohl die Kombination aus hCC und GFP-hCC nicht ideal war und nur zur Evaluierung im Platten-basiertem Format verwendet wurde, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass mAb CyDI-4 ein hervorragender Antikörper für den Verdrängungsassay ist.

The interest in diagnostic biochips is growing. However, most biochips are designed for ex vivo applications. Beyond, an elevated serum human cystatin C (hCC) concentration correlates with various diseases. Thus, hCC was suggested as biomarker. To meet the requirements of an implantable biochip system it is essential to develop an hCC-specific bioassay enabling repetitive measurements.Within this PhD thesis an hCC-specific bioassay was developed which is based on the concentration-dependant replacement between hCC and an hCC-fusion protein on an hCCspecific antibody layer thus enabling the repetitive determination of the hCC concentration. Therefore hCC, hCC-fusion proteins and glutathione S-transferase (GST) were successfully cloned, produced and purified. The fusion protein stGST-hCC was further used for the immunization of mice. Thereby an hCCspecific immune response could be induced. With the use of the hybridoma generation technology monoclonal hybridoma cell lines were established, which enabled the selection and production of hCC-specific mAbs. The selection of monoclonal hybridoma cell lines which produced hCC-specific antibodies was successful due to analysis by indirect ELISA, sandwich ELISA and surface plasmon spectroscopy (SPR)-spectroscopy. Selected hybridoma cell lines were used for small scale production of hCC-specific mAbs which without purification were analysed for their hCC association and dissociation characteristics by SPR spectroscopy. From 12 initially potential antibodies, 5 were identified to display specific yet distinct association and dissociation characteristics towards hCC. For the replacement assay the dissociation characteristics were of special interest, thus they were used to rank the antibodies. Whereas mAb CyDI-1 showed no and CyDI-12 showed barely any dissociation, it was clearly seen for mAb CyDI-2, CyDI-4 and to the highest degree for mAb CyDI-3. The five corresponding hybridoma cell lines were used for the large scale production of mAbs, all producing mAbs of the IgG1:κ isotype. All mAbs were purified by Protein G-affinity chromatography, yielding pure protein. Due to their accessibility mAb CyDI-1, CyDI-2 and CyDI-4 were further analysed by SPR spectroscopy. This time hCC-fusion proteins were used beside hCC for the identification of suitable hCC and hCC-fusion protein combinations for the replacement assay. The mAb CyDI-4 was identified as the antibody with the highest potential for enabling replacement. Except for enhanced green fluorescent protein (GFP)-hCC, all fusion proteins and hCC showed exactly identical association and dissociation behaviour towards hCC. The combination of hCC and stGST-hCC was identified to be best by SPR spectroscopy, especially in respect to the end application. However, the evaluation of the hCC-specific bioassay in the predicted chip-based detection system was not possible until the end of this study. In parallel to the chip evolution, a fluorescence-based replacement assay was established for the evaluation of the replacement ability on mAb CyDI-4. Thus, the discrimination between hCC and the hCC-fusion protein was possible without the modification of antigens and the use of secondary antibodies, respectively, which was essential as the former may alter the affinity and the latter is not involved in the final bioassay. Using the mAb CyDI-4 and the antigen combination composed of hCC and GFP-hCC a fluorescence-based replacement assay was developed, which meets the implant requirements regarding the assay duration, the compatibility with human serum and the required sensitivity for physiological and most of the pathological conditions. Additionally, the assay standard deviation decreased upon use of reference material (hCC spiced human serum) while maintaining the sensitivity. However, the repetitive replacement assays revealed the replacement to slightly favour one replacement direction, as was predicted by SPR analysis for hCC and GFP-hCC. Although the combination of GFP-hCC and hCC was not ideal, and was only used to fulfil the detection requirements in plate-based format, the results indicate that mAb CyDI-4 is an excellent antibody for the hCC-specific replacement assay.

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