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000464534 245__ $$aDesign of biohybrid catalysts for metathesis reactions$$cvorgelegt von Marcus Arlt$$honline, print
000464534 246_3 $$aDesign von Biohybrid-Katalysatoren für Metathesereaktionen$$yGerman
000464534 260__ $$aAachen$$bPublikationsserver der RWTH Aachen University$$c2015
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000464534 5203_ $$aBiohybridkatalysatoren stellen eine neue Klasse von Katalysatoren dar, die aus Übergangsmetallkomplexen gebunden an Biomoleküle, beispielsweise Proteinen, bestehen. Biokatalytische Umsetzungen werden verbunden mit umgebungskontrollierten Reaktionen hoher katalytischer Aktivität und Selektivität und milden Reaktionsbedingungen. Übergangsmetallkatalyse hingegen zeichnet sich durch Kontrolle mittels physikalischer Parameter aus und zeigt hohe Vielfalt an verwendbaren Lösungsmitteln und Metallen für verschiedenste Reaktionen. Die Verbindung dieser komplementären Eigenschaften der Protein-Liganden-Sphäre und den hochaktiven Metallkomplexen ermöglicht bio-anorganische Katalysatoren, die Metallkomplexe mit Selektivität ausstatten, Reaktion beschleunigen und systematische Verbesserungen erlauben. Diese Chemogenetische Optimierung durch Katalysatordesign und Proteinverbesserung mittels gelenkter Evolution erlaubt es, synthetische Herausforderungen in organischer Chemie und Biokatalyse zu überwinden. Die ring-öffnende metathetische Polymerisation (ROMP) stellt eine wirkungsvolle Reaktion für die Synthese vielfältiger funktioneller Polymere dar. RMOP in wässriger Umgebung resultiert, verglichen mit organischen Lösungsmitteln, in hochmolekularen Polymeren mit geringen PDI-Werten und hohen Initiationsraten. Wasserlösliche Grubbs- und Grubbs-Hoveyda-Katalysatoren zeigten hohe Reaktivität in ROMP gegenüber 7-Oxanorbonen-Derivaten mit vorzugsweiser trans-Selektivität. Allerdings wurde bisher noch keine cis-Selektivität gezeigt. Zu diesem Zweck zielen wir, in Zusammenarbeit mit dem AK Okuda (IAC, RWTH Aachen) und dem AK Hayashi (Osaka University), in dieser Studie darauf ab, Biohybridkatalysatoren für stereokontrollierte ROMP zu entwickeln. Das Membranprotein FhuA wurde als biomolekulare Umgebung für einen Grubbs-Hoveyda-Katalysator ausgewählt, aufgrund seiner widerstandsfähigen β-Fassstruktur und seiner hohen Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln und erhöhten Temperaturen, die die Einsatzmöglichkeiten von FhuA-basierten Biohybridkatalysatoren erhöhen können. Der Schwerpunkt meiner Doktorarbeit war die Optimierung von FhuA zur Bindung des Grubbs-Hoveyda-Katalysators und die Beeinflussung der Selektivität des entwickelten Biohybridkatalysators mittels gelenkter Proteinverbesserung.Diese Arbeit stellt die erste Synthese eines Biohybridkatalysators für ROMP dar. Mit dem Biohybridkatalysator konnten dabei Ausbeuten von 35 % und eine leicht veränderte Stereoselektivität erreicht werden. Der FhuA-Grubbs-Hoveyda Biohybridkatalysator gehört zu einer neuen Klasse von Katalysatoren basierend auf dem verbesserten Membranprotein FhuA mit einer definierten Bindungsstelle innerhalb des Proteinkanals. Ein Grubbs-Hoveyda-Komplex wurde, mittels einer Maleimidgruppe, erfolgreich kovalent an ein einzelnes freies Cystein an Position 545 gebunden. Die Bindungstasche wurde so designed um die kovalente Bindung des Katalysators un dessen Aktivität sicherzustellen. Zu diesem Zweck wurden zwei Punktmutationen Glu501Phe und Arg548Val eingeführt. Zusätzliche Schnittstellen für die Tobacco etch virus (TEV)-Protease in den extrazellulären Schleifen ermöglichten die massenspektrometrische Untersuchung der kovalenten Bindung mittels MALDI-TOF-MS. Die resultierende Variante FhuA ΔCVFTEV wurde erfolgreich produziert und charakterisiert. Die entwickelte optimierte SDS-basierte Extraktionsmethode ermöglichte Proteinkonzentration von mehr als 4 mg/ml mit Reinheiten über 90%. Faltungs- und Stabilitätscharakteristika wurden untersucht mittels Circular Dichroism Spektroskopie und zeigten außerordentliche Lösungsmitteltoleranz (bis zu 20 %THF und 20 % Isopropanol) und pH-Stabilität (pH 5.5-10). Eine fluoreszenzbasierte Cysteintitration wurde verwendet um die Kupplungseffizienz zu bestimmen. Die Biohybridplattform wurde ausgedehnt auf weiter Ruthenium- und Rhodium-Komplexe, für welche ebenfalls die erfolgreiche kovalente Bindung bestätigt werden konnte. Unterstützt durch computerbasierte Modelle wurden weiter FhuA Varianten mit bis zu vier Tyrosinaustauschen generiert um Einblick in den Einfluss von Aminosäureaustauschen auf die Biohybridkatalysator-Selektivität zu erhalten.$$lger
000464534 520__ $$aBiohybrid catalysts are a new type of catalysts composed of transition metal complexes bound to biomolecular scaffolds, e.g. proteins. Biocatalytic transformations are associated with reaction control through space resulting in high catalytic efficiency and selectivity as wells as operation under mild conditions. Transition metal catalysis is characterized by a reaction control through physical parameters and a broad variety of solvents and metals for different reactions. Combining the complementary features of the proteins second ligand sphere and the highly active transition metal catalysts leads to biological-inorganic catalysts which impart selectivity to metal catalysts, accelerate chemical reactions, and cover the ability for systematic optimization. The chemogenetic optimization by catalyst design and protein engineering with directed evolution allows overcoming synthetic challenges in organic chemistry and biocatalysis (e.g. limited reaction scope for enzymes and limited enantioselectivity for homogenous metal catalysts).The ring-opening metathesis polymerization (ROMP) is a powerful reaction for the preparation of a wide range of functional polymers. ROMP in aqueous solution produces polymers with lower PDI values and higher molecular mass and has faster initiation rates compared to ROMP in organic solvents. Water soluble Grubbs and Grubbs-Hoveyda type catalysts have shown ROMP activity with 7-oxanorbonene derivatives in aqueous media with preferential trans selectivity, but no preferential cis-selective catalysts have been published yet. Therefore in collaboration with Okuda group (IAC, RWTH Aachen) and Hayashi group (Osaka University), we aim to develop biohybrid catalysts for ROMP. The membrane protein FhuA was selected as scaffold to accommodate Grubbs-Hoveyda type catalysts due to its rigid β-barrel channel structure and high resistance towards organic solvents and elevated temperatures which broaden the application range of FhuA biohybrid catalysts. The focus of my PhD project was to reengineer FhuA for coupling with Grubbs-Hoveyda type catalysts and tuning the selectivity of the developed biohybrid catalyst through protein engineering.This work represents the first example of a biohybrid catalyst for ROMP with yields around 35 % and slightly altered stereoselectivity (54:46 in favor of the cis-product). FhuA-Grubbs-Hoveyda is a new type of biohybrid catalysts based on the designed membrane protein FhuA with the binding site in the channels interior. A Grubbs-Hoveyda type catalyst was covalently coupled with a maleimide moiety to the single free cysteine at position 545 of FhuA. The binding cavity was designed to ensure catalyst coupling and activity by introducing two point mutations Glu501Phe and Arg548Val. Cleavage sites for the tobacco etch virus (TEV)-protease in the extracellular loops enabled the detection of coupled Grubbs-Hoveyda-type catalysts at the free single cysteine by MALDI-TOF-MS. The FhuA ΔCVFTEV-variant was successfully expressed. An optimized extraction method using sodium dodecylsulfate (SDS) as solubilizing detergent resulted in 4 mg/ml with purities above 90 %. The folding and stability characteristics of FhuA were investigated using circular dichroism spectroscopy, revealing an extraordinary organic solvent tolerance (up to 20 % THF, up to 20 % isopropanol) and pH stability (pH 5.5 to 10). Cysteine titration was used to determine the coupling efficiency. The biohybrid catalyst toolbox was broadened with further ruthenium and rhodium based catalysts for which a successful anchoring to the protein was shown. Supported by computational modeling four FhuA variants with up to four tyrosine substitutions were generated and produced to gain insights on amino acid substitutions that govern the biohybrid catalysts’ stereoselectivity.$$leng
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