Generation of recombinant antibody fragments specific formurine mesangial cells : functionalization of highly specific fusion proteins for diagnostic approaches and the development of a murine mesangioproliferative glomerulonephritis disease models

Bogner, Pamela; Barth, Stefan; Elling, Lothar

doi:1999910016909

Generation of recombinant antibody fragments specific formurine mesangial cells : functionalization of highly specific fusion proteins for diagnostic approaches and the development of a murine mesangioproliferative glomerulonephritis disease models = Generierung rekombinanter Antikörperfragmente spezifisch für murine Mesangialzellen : Funktionalisierung hochspezifischer Fusionsproteine für diagnostische Ansätze und die Entwicklung eines murinen Krankheitsmodells für Mesangioproliferative Glomerulonephritis

Bogner, Pamela (Author)

2014 & 2015

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Pamela Bogner

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2014

Umfang142 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Prüfungsjahr: 2014. - Publikationsjahr: 2015

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Barth, Stefan (Thesis advisor) ; Elling, Lothar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-11-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-53075
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/465405/files/5307.pdf

Einrichtungen

Lehr- und Forschungsgebiet Experimentelle Medizin und Immuntherapie (811001-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Glomerulonephritis (Genormte SW) ; Mesangiale Immunglobulin-A-Glomerulonephritis (Genormte SW) ; Antikörperbildung (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Phagen-Display (frei) ; Phagen Display (frei) ; Antikörpergenerierung (frei) ; Mesangioproliferative Glomerulonephritis (frei) ; scFv-Fc Fusionsproteine (frei) ; phage display (frei) ; antibodygeneration (frei) ; mesangioproliferative glomerulonephritis (frei) ; scFv-Fc fusion proteins (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Chronische Niereninsuffizient zählt nach wie vor zu den vorherrschenden und am meist verbreitetsten Erkrankungen in den westlichen Ländern. Ihre Ursachen sind vielfältig: neben genetisch fixierten Nierendefekten ist ein Nierenversagen häufig auch eine Begleiterkrankung, welche durch schwere Vergiftungen, Diabetes oder rheumatoide Erkrankungen ausgelöst werden kann. Durch die Komplexität dieser Zusammenhänge sind therapeutische Ansätze oft schwierig und eher von palliativem, als von kurativem Charakter und beinhalten Immunsuppression der Patienten, Organtransplantationen und Dialyse, um nur die wichtigsten zu nennen. Gerade im Fall von mesangioproliferativen Erkrankungen wie der IgA Nephropathie ist jedoch ein mechanistisches Verständnis absolut dringlich von Nöten. Noch immer fehlt es an ausreichenden, passenden Tiermodellen. In Rahmen dieser Arbeit wurde eine innovative, einzigartige Phage Display Selektionsmethode etabliert, die es uns ermöglichte höchst spezifische Antikörperfragmente gegen murine Mesangialzellen zu generieren und diese zu charakterisieren. Dieser spezielle Zelltyp spielt eine Schlüsselrolle in mesangioproliferativen Glomerulonephritiden. Die selektierten C9-(scFv), E4-(scFv) und B4 (scFv) Antikörperfragmente wurden mithilfe eines murinen IgG2a Fc-Teils zu antikörperähnlichen Chimeren fusioniert deren Bindeeigenschaften auf den Zielzellen in verschiedenen Matrizes untersucht wurden. Der in dieser Arbeit zur Spezifitätsanalyse verfolgte Ansatz war von subtraktivem Charakter. Neben der Bindeanalyse auf gesunden systemischen Organen wie Lunge, Herz, Milz oder Leber wurden die Antikörperchimeren zusätzlich in Co-Lokalisationsstudien gegen einzelne Zelltypen eingesetzt. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass die scFv-Binder hochspezifisch für murine, mesangiale Regionen sind und weder in anderen Geweben noch an Zelltypen binden die zu den Mesangialzellen im Glomerulus benachbart liegen. Nichts desto trotz wurde das Zielantigen der drei selektierten mMC Binder noch nicht identifiziert. Untersuchungen hierzu sind jedoch von großer Wichtigkeit um therapeutische Ansätze glomerulärer Nephritiden voran zu treiben. Eine massenspektrometrische Analyse von quervernetzen und nachfolgend immunpräzipitierten scFv-Fc Bindern und deren Zielzellen ist hier ein vielversprechender Weg. Bisher waren wir in unsere Arbeitsgruppe nicht in der Lage solche Experimente erfolgreich zu etablieren, allerdings ist dies nach wie vor von hohem Interesse und entsprechende Schritte werden verfolgt. Wir konnten für jedes einzelne scFv-Fc Protein eine hoch spezifische Erkennung und Detektion muriner Mesangialzellen in deren natürlicher Gewebsumgebung zeigen. Die Nutzbarmachung dieser exklusiven und neuen mMC spezifischen, antikörperähnlichen Fusionsproteine stellt einen guten Startpunkt für diagnostische und deskriptive Ansätze muriner Nierenkrankheitsmodelle dar. Durch die Fusion an eine Fc-Domäne sollten die Antikörperchimere als externer Trigger für die Krankheitsinduzierung eines neuen murinen Tiermodels der mesangioproliferativen Glomerulonephritis eingesetzt werden. Entsprechend der Progression und Transformation der anti-Thy1.1 Rattennephritis sollte die einmalige Applikation unsere mMC spezifischen Antikörper zu einer mesangialen Zelllyse, einer Hyperproliferation verbleibender Mesangialzellen, sowie eine Akkumulation und Agglutination extrazellulärer Matrix im Mesangium auslösen. Innerhalb dieser Arbeit ist es uns nicht gelungen ein solches Tiermodell in der Maus zu etablieren. Mit der Generierung der scFv-Fc Fusionen wurde jedoch der Grundstein für weitere Untersuchungen in diese Richtung gelegt. Speziell die Funktionalisierung der Fusionsproteine über ihren recombinanten SNAP-Tag-Anker ermöglicht eine Vielzahl unterschiedlicher Wege eine mesangioproliferative Entzündung zu induzieren. Der rekombinante Tag macht die generierten scFv-Fc Proteine zu einer hochspezifischen Trägersubstanz verschiedener Effektordomänen. Gerade das direkte Markieren unserer Proteine mit spezifischen, toxischen Agentien wie dem Pseudomonas Exotoxin ETA oder immunsystemstimulierender Substanzen wie Wachstumsfaktoren haben hier großes Potential. Sie könnten dadurch eine direkte Zelllyse, sowie das Rekrutieren von Makrophagen in den glomerulären Knoten initiieren und dadurch eine komplementvermittelte, entzündliche Antwort ähnlich der des anti-thy-1 Modells hervorrufen. Weitere Verbesserungen und Optimierungen unserer scFv-Fc Fusionsproteine, zusammen mit Veränderungen und Anpassungen des experimentellen in-vivo Ansatzes können den Zugang zu einem großen Gebiet genetisch manipulierter Mausmodelle eröffnen. Sie können diese Modelle nutzbar machen um ein besseres Verständnis für die Mechanismen mesangioproliferativerGlomerulonephritiden und möglicher Therapieansätze zu erhalten.

One of the most prevalent and widespread diseases in western countries still is chronic renal failure. The reasons for that are manifold: besides genetically fixed renal issues, renal failure often is a concomitant disease induced as a consequence of severe intoxications, diabetes or rheumatoide diseases. Due to these complex correlations, therapeutic approaches are often difficult and more of a palliative than a curative character, only to mention immune suppression, organt ransplantations or dialysis. Especially in mesangioproliferative diseases like the IgA Nephropathy a basic mechanistic understanding is of absolutely urgent need,due to very limited access to suitable animal models. Within this work an innovative, unique Phage Display selection procedure was established, from which antibody fragments highly specific for murine mesangial cells were generated and characterized. This cell type represents a key player in mesangioproliferative glomerulonephritis. The C9-(scFv), E4-(scFv) and B4-(scFv)antibody fragments were each fused to a murine IgG2a-Fc portion, leading to an antibody-like chimera protein. Their binding characteristics towards the target cells in different matrices were investigated. The analysis performed during this thesis aimed to show mMC specificity on the basis of a substractive approach. Crossreactivity investigations on healthy competitor tissues like lung, heart, spleen and liver were performed followed by substractive co-localization studies with cell types closely related to the mesangial cells. It was clearly shown that all of the generated scFv-binders are highly specific for mesangial regions and do not bind on other tissues or cell types neighboured in the glomerulus. Nevertheless, the target antigens of the three selected mMC binders were not yet identified. Such investigations are of urgent need to promote therapeutic approaches. Regarding this, mass spectrometry analysis of cross-linked and immunoprecipitated scFv-Fc binders on the target cells is a promising step. So far we were not able to establish such experiments within our group, but this is still of major interest and appropriate steps are initiated. A highly specific recognition of murine mesangial cells within their natural tissue environment was proven for each of the three scFv-Fc fusion proteins. The utilization of these exclusive and newly murine MC specific, antibody-like fusion proteins is a reasonable path forward in diagnostic and descriptive approaches of murine kidney disease models. Fused to the Fc-portion the highly specific mMC binders should be used as an external trigger for the initiation of a new murine animal model for mesangioproliferative glomerulonephritis (GN). Following the disease progress and transformation of the anti-thy 1 nephritis in rats, the idea was to induce mesangial cell lysis, hyper-proliferation of residual cells within the glomerular structure as well as accumulation and agglutination of extracellular matrix within the mesangium by injection of a single portion of scFv-Fc fusion protein. Within the present work we did not succeed to establish such a murine animal model, but prepared the ground for further investigations into this direction. Especially the functionalization of the scFv-Fc proteins via their included recombinant SNAP-tag anchor allows a huge variety of further disease induction approaches. It allows the usage of the generated scFv-Fc fusions as highly cell specific delivery vehicles for different effector moieties. Direct labelling of our proteins with specific cytotoxic agents like Pseudomonas exotoxin A (ETA) or immune stimulating agents like growth factors via the SNAP-tag have the potential to induce site directed cell lysis and macrophage recruitment within the glomerular tuft and therefore mimic the complement derived inflammatory response described for the anti-Thy 1.1 nephritis. Further engineering of our scFv-Fc fusion proteins via the SNAP-tag combined with alterations and modifications in the experimental in-vivo set-up can help to open the wide field of genetically manipulated mouse models and utilize them to gain better understanding of the mechanisms involved in mesangioproliferative glomerulonephritis.

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