Generierung Plasmodium falciparum-spezifischer humaner Antikörperformate aus Epstein-Barr Virus-transformierten B Lymphozyten semi-immuner Individuen

Maskus, Dominika J.; Fischer, Rainer; Barth, Stefan

doi:HT018865024

Generierung Plasmodium falciparum-spezifischer humaner Antikörperformate aus Epstein-Barr Virus-transformierten B Lymphozyten semi-immuner Individuen = Generation of Plasmodium falciparum-specific human antibody formats from Epstein-Barr virus-transformed B lymphocytes from semi-immune individuals

Maskus, Dominika J.

2015 & 2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologin, Diplom-Wirtschaftsbiologin Dominika J. Maskus aus Aachen

ImpressumAachen 2015

Umfangiv, 114, xxxiv Blätter : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2015

Druckausgabe: 2015. - Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor) ; Barth, Stefan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-02-24

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-029931
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/479271/files/479271.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/479271/files/479271.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Malaria ist und bleibt eine der größten globalen gesundheitspolitisch relevanten Herausforderungen. Anfang des letzten Jahrhunderts zeigte sich bereits, dass passive Vakzinierungsstrategien mit polyklonalen Antikörpern semi-immuner Individuen vielversprechend sind. Bisher sind jedoch nur wenige humane monoklonale anti-plasmodiale Immunglobuline isoliert und charakterisiert worden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, aus B Zellen semi-immuner ghanaischer Spender humane Volllängenantikörper zu generieren, welche eine Spezifität für Plasmodium falciparum besitzen und inhibitorisch wirken. Die Methode der Wahl umfasste (1) die EBV Transformation durchflusszytometrisch angereicherter reifer, antigenspezifischer B Lymphozyten, (2) die Sicherung der VH-, Vkappa- und Vlambda-Sequenzen ihrer Immunglobuline und (3) deren Expression als IgG1:kappa- oder IgG1:lambda2-Volllängenantikörper in N. benthamiana. Die Validierung und Charakterisierung der so generierten anti-plasmodialen Antikörper erfolgte mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie und Wachstumsinhibitonstests in vitro. Neuartig an dieser Herangehensweise war es, ausschließlich die durchflusszytometrisch isolierten, antigenspezifischen B Zellen zu transformieren. Dies ist bisher noch nicht beschrieben worden und erlaubt eine ressourcenschonendere und effizientere EBV Transformation. Die vorliegende Arbeit kann folglich ebenfalls als Machbarkeitsstudie und Prozessoptimierung verstanden werden. Es wurden vier humane monoklonale Antikörper (humAbs) des anti-plasmodialen Immunglobulinrepertoires semi-immuner Spender isoliert, kloniert und charakterisiert. Drei der humAbs erkannten das Merozoitenoberflächenprotein 10 (MSP10), einer das Apikale Membranantigen 1 (AMA1). Zuvor sind noch keine MSP10-reaktiven monoklonalen Antikörper isoliert worden. Monoklonale AMA1-spezifische Antikörper humanen Ursprungs sind bisher ebenfalls noch nicht in der Literatur beschrieben worden. Jene drei Antikörper, die auf die authentische Paarung von schwerer und leichter Ketten zurückgingen, erwiesen sich als hochaffinitätsgereift (mindestens 39-59 Mutationen auf DNS-Ebene) und hochaffin für ihre jeweiligen Antigene (KD = 5,46 x 10-9 M –1,99 x 10-10 M). In Inhibitionstests zeigten die MSP10-spezifischen Antikörper in vitro eine stammabhängige Hemmung. Stamm 3D7 wurde mit EC50-Werten zwischen 4,1 mg/mL und 9,5 mg/mL inhibiert. Bei den Stämmen HB3 und Dd2 wurde eine maximale Hemmung von ca. 39% bei 10 mg/mL IgG beobachtet. Im Gegensatz hierzu war der AMA1-reaktive humAb (humAbAMA1) panspezifisch und (hoch)inhibitorisch für alle getesteten P. falciparum-Stämme (EC50 = 34,9 μg/mL – 3,8 mg/mL). Bezüglich der Funktionsweise des humAbAMA1 ist davon auszugehen, dass dieser – ähnlich wie mAb1F9 – in der hydrophoben Tasche des AMA1 bindet und so die Interaktion mit RON2 stört, welche für den Invasionsprozess essentiell ist. Ein geeignetes Einsatzgebiet der drei generierten MSP10-spezifischen humAbs scheint vornehmlich in der Grundlagenforschung zu liegen. HumAbAMA1 scheint darüber hinaus ein geeigneter Kandidat für passive Immunisierungsstrategien zur Malariaprophylaxe und -therapie.

Malaria tropica, caused by Plasmodium falciparum still poses a major challenge to global health care as well as to the economy in endemic countries. There is no efficient vaccine at hand, and multiple drug-resistant parasite strains are emerging. As yet, passive vaccination strategies with recombinant full-size human monoclonal antibodies (humAbs) are not pursued despite the fact that it has been shown early that these may confer passive immunity toward as well as effectively cure malaria infections by P. falciparum. The major goal of the present thesis was thus to generate anti-plasmodial human monoclonal antibodies (humAbs) which are highly specific, possess a high affinity, and are capable of inhibiting P. falciparum. To this end antigen-specific IgG+ / CD22+ B cells from semi-immune Ghanaian donors were enriched by flow-cytometric cell sorting and were then subjected to EBV transformation. VH-, Vkappa-, and Vlambda sequences of promising cultures were rescued and cloned into plant expression vectors. These V regions were then produced in thecontext of full-size IgG1:kappa and IgG1:lambda2 antibodies in Nicotiana benthamiana. Confocal immunofluorescence microscopy, surface plasmon resonance measurements and in vitro growth inhibition assays served to characterize the isolated humAbs. The flow cytometric enrichment of antigen-specific B cells prior to their virocrine transformation can be considered a novelty. This approach allows for a more efficient EBV transformation requiring less personnel and material. From this point of view, the work presented can also be regarded as a feasibility study as well as a process optimization. Four anti-plasmodial humAbs were isolated, cloned and characterized. Three of these humAbs recognized Merozoite Surface Protein 10 (MSP10). So far monoclonal anti-MSP10 antibodies have not been described yet. The fourth antibody was specific to Apical Membrane Antigen 1 (AMA1). To the best of our knowledge, this is the first human AMA1-specific antibody to be described. Those three antibodies which possessed the genuine pairing of heavy and light chains were highly maturated (at least 39-59 DNA mutations) and highly affine to their respective targets (KD = 5.46 x 10-9 M – 1.99 x 10-10 M). In growth inhibition assays the MSP10-specific humAbs inhibited P. falciparum in a strain-dependent fashion. Strain 3D7 showed EC50-values in the range of 4.1 mg/mL – 9.5 mg/mL. The maximal inhibition of strains HB3 and Dd2 was around 39% at 10 mg/mL IgG. In contrast, the AMA1-reactive humAb (humAbAMA1) was panspecific and (highly) inhibitory for all P. falciparum strains tested (EC50 = 34.9 μg/mL – 3.8 mg/mL). Regarding the possible mode of action humAbAMA1 likely binds in the hydrophobic trough of AMA1 and thus torpedoes its interaction with RON2. It is generally accepted that the formation of the AMA1:RON2 complex is vital to the invasion of merozoites into new red blood cells. Whereas the three MSP10-specific humAbs seem to be suitable primarily for basic research humAbAMA1 additionally appears to be an ideal candidate for passive immunization strategies for malaria prophylaxis and therapy.

OpenAccess:
PDF PDF (PDFA)
(additional files)