Analyse verschiedener Netzhautkulturmodelle an der Netzhaut vom adulten Hausschwein

Müller-Kämpf, Stefanie; Walter, Peter

doi:HT015579976

Analyse verschiedener Netzhautkulturmodelle an der Netzhaut vom adulten Hausschwein = Analysis of various retina culture models of retina from adult pig

Müller-Kämpf, Stefanie

2007 & 2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Stefanie Müller-Kämpf

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2007

UmfangVIII, 117 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Prüfungsjahr: 2007. - Publikationsjahr: 2008

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Walter, Peter (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2007-12-18

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-21169
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50107/files/Mueller-Kaempf_Stefanie.pdf

Einrichtungen

Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung - IZKF Aachen (529500-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Netzhaut (Genormte SW) ; Stäbchenzelle (Genormte SW) ; Zapfenzelle (Genormte SW) ; Gewebekultur (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Immunohistologie (Genormte SW) ; Schwein (Genormte SW) ; Vimentin (Genormte SW) ; Glutaminsynthetase (Genormte SW) ; Glia (Genormte SW) ; Astrozyt (Genormte SW) ; Kollagen (Genormte SW) ; Fibrose (Genormte SW) ; Gliose (Genormte SW) ; Auge (Genormte SW) ; Pigmentepithel (Genormte SW) ; Aderhaut (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; RPE (frei) ; S100 (frei) ; Choroidea (frei) ; Minuth (frei) ; Perfusionskultur (frei) ; choroid (frei) ; perfusion culture (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Netzhautkultur stellt ein in vitro-System dar, um neuronale und gliale Interaktionen und Prozesse zu analysieren. In der vorliegenden Arbeit wurde verschiedene Netzhautkultur-modelle vom adulten Hausschwein immunhistologisch untersucht und mit der frisch präparierten Netzhaut als Kontrollnetzhaut zu Beginn der Kultur verglichen. Die Kontrollnetzhaut zeigte im histologischen Ergebnis, bis auf eine frühe Degeneration der Photorezeptoraußensegmente und einer Reduktion der Ganglienzellkerne, ein Bild entsprechend der in vivo-Netzhaut. Durch beide GFAP-Antikörper wurden gleichermaßen Astrozyten markiert, während in dieser Studie für den GFAP-und Vim-Gehalt in Müllerzellen je nach Wahl des Antikörpers differente Ergebnisse feststellbar waren. So zeigten Müllerzellen der Kontrollnetzhaut eine GFAP1-Markierung, jedoch keine eindeutige Anti-GFAP2-Färbung, Anti-Vim1-markierte apikale Müllerzellendfüße und eine Anti-Vim2-Färbung der gesamten Müllerzellen. Ent-sprechend den Literaturdaten zeigte die Kontrollnetzhaut eine Anti-S100b-Markierung der Müllerzellen und Astrozyten und eine Glutaminsynthetasefärbung der gesamten Müllerzellen. Die immunhistologischen Resultate der Kontrollnetzhaut belegen, dass die Netzhaut nach der Präparation bzw. zu Beginn der Kultur, bis auf die Schädigung der Photorezeptorzellen, der gesunden Netzhaut entspricht. In dieser Arbeit wurde eine semiquantitative Bildanalyse der fluoreszenzmarkierten, immunhistologischen Färbungen verwendet, um die verschiedenen Netzhautkulturen miteinander und mit der Kontrollnetzhaut vergleichen zu können. Der Vergleich der semiquantitativ ermittelten Werte zu den Literaturdaten zeigte, dass die Anti-GFAP2- und auch Anti-Vim1-markierten Strukturen der Inneren plexiformen Schicht und Inneren Körnerzellschicht der Netzhaut den tatsächlichen Volumenanteil der Müllerzellen wiederspiegelt. Für GFAP1, Vim2, S100b und GS sind die semiquantitativen Werte höher als das in der Literatur ermittelte Müllerzellvolumen. Die Netzhaut wurde zunächst ohne RPE über den Kulturzeitraum von einem, 3 und 5 Tagen in der statischen Netzhautkultur kultiviert. Für diese Netzhautkulturen konnte über der Kulturzeitraum eine Abnahme der Ganglienzellkerne, eine fortschreitenden Photorezeptordegeneration und eine zunehmende Hypertrophie der Müllerzellen festgestellt werden. Über den Kulturzeitraum von einem und drei Tagen konnte eine Zunahme von GFAP, Vim, S100b und Glutaminsynthetase beobachtet werden, während nach 5 Tagen Netzhautkultur eine weitere Zunahme von GFAP, S100b und GS sowie eine Reduktion von Vim in Müllerzellen und Astrozyten festzustellen war. Nach 5 Tagen Netzhautkultur sind Prozesse zur Unterstützung neuronalen Überlebens, aber auch beginnender glialer Proliferation zu beobachten. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass entgegen den Daten der Literatur, keine Coexpression von GFAP und Vim in Müllerzellen vorliegt, da diese Intermediärfilamente eine Gruppe von Polypeptiden bilden und je nach Antikörperwahl unterschiedliche Ergebnisse zeigen. Zudem ändert sich das GFAP-Vim-Verhältnis in Gliazellen im Verlauf der Netzhautkultur. Neben der beschriebenen Netzhautkultur wurde eine Netzhaut-RPE/Choroidea-Cokultur etabliert, für die Gewebe getrennt präpariert und anschließend entsprechend der in vivo-Orientierung gemeinsam 3 Tage kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die RPE-Cokultur für das Überleben retinaler Zellen von Vorteil ist. So waren unter Cokultur des RPEs eine verminderte Ganglienzellapoptose, eine Reduktion der Photorezeptordegeneration und des Zellkernverlusts in beiden Körnerzellschichten zu beobachten. Zudem lag in der RPE-Cokultur eine signifikant geringere Zunahme gliazellspezifischer Proteine, wie GFAP1, GFAP2, Vim1 und Vim2 vor. Die dynamischen Netzhautkulturen in einer Minuthkammer zeigten eine reduzierte Degeneration und Proliferation retinaler Zellen, was durch die bessere Medium- und Sauer-stoffversorgung, sowie in den Druckverhältnissen in der Minuthkammer begründet ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass kultivierte Müllerzellen nach in vivo-Injektion gliotische Membranen induzieren und reichlich Kollagen I exprimieren. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die Netzhautkulturen mit apikalen Müllerzellen auf der ILM oder Kollagen I im Kulturmedium ähnliche histologische Merkmale zeigen, die auf eine beginnende epiretinale bzw. intraretinale Gliose hinweisen und somit als gliotisches Netzhautkulturmodell verwendet werden können. In Netzhautkultur mit apikal applizierten Müllerzellen konnte für alle gliaspezifischen Proteine (GFAP, Vim, S100b und GS) eine Zunahme in den apikalen Müllerzellfortsätzen bis hin zur INL festgestellt werden. Kollagen I, für das bereits in Müller-zellkultur ein proliferationsstimulierender Einfluss festgestellt wurde, zeigte auch in Netz-hautkultur eine Zunahme von GFAP- und S100b in den apikalen sowie eine Reduktion von Vim, S100b- und GS in den basalen Müllerzellfortsätzen.

Retina tissue culture represents an in vitro system to analyze neuronal as well as glial interactions and molecular processes. In the present work different retina tissue culture systems from the adult porcine eyes were examined by immunohistology and results compared to freshly isolated retina as positive control. The control retina displays histological characteristics of in vivo retina, except for an early degeneration of photoreceptor outer segments and a minor reduction of ganglion cell bodies. Astrocytes in control retina could be visualized reproducibly by both GFAP antibodies in immunohistology, whereas variable expression patterns of GFAP and Vim were found in Muller cells depending on variations in antibody specificity. Muller cells in control retina showed GFAP1 labelling however no clear anti-GFAP2 staining could be detected; anti-Vim1 antibody labelled apical Muller cell end feet whereas anti-Vim2 antibody displayed staining of the entire Muller cell. According to the literature S100b-antibodies detect Muller cells and astrocytes in freshly isolated retinal tissue whereas glutamin synthetase antibodies label Muller cells exclusively. Comparison of immunohistological results from freshly isolated, control retina to healthy retina (in vivo situation) verified their identical histological characteristics, except for photoreceptor degeneration. In the present work semiquantitative image analysis of fluorescence labelled, immunhistological sections were used for comparison of different retina cultures to freshly isolated retina. The comparison of this semiquantitative data to the literature proved that anti-GFAP2 and also anti-Vim1-labelled structures of the inner plexiform and the inner nuclear layer correspond to the actual volume of Muller cells. The semiquantitative results for anti-GFAP1, anti-Vim2, anti-S100b and anti-GS staining indicate higher Muller cell volumes than those published previously. The retinas were cultured without RPE over a period of one, 3 and 5 days. For these cultures a reduction in ganglion cell nuclei, a progressive degeneration of photoreceptor cells and an increase of Muller cell hypertrophy was observed over the cultivation period. Over the culture period of one and 3 days an increase of GFAP, Vim, S100b and glutamin synthetase could be observed whereas after 5 days cultures showed further increase of GFAP, S100b and GS as well as reduction of Vim in Muller cells and astrocytes. After 5 days of culture cellular mechanisms were identified supporting neuronal survival; however at this time an onset glial proliferation was observed. In this study, in contrast previous publications Muller cells did not display co-expression of GFAP and Vim; however this is explained by the fact that these intermediate filaments represented by a group of polypeptides. Various binding options to these polypeptides for different antibodies may result in variable immunohistological results. Furthermore is the relation of GFAP expression to Vim expression object to change in the time course of retina culture. In addition the co-culture of retina/RPE-choroid complexes was established. For this technique retina as well as the RPE-choroid complex were isolated separately and cultured for 3 days after juxtaposing both tissues in their original orientation. It has been shown that RPE co-culture supports survival of retinal cells. It could be observed improved ganglion cell and photoreceptor survival, limited nuclei loss in both nuclear cell layers, and decreased hypertrophy of Muller cells in retina-RPE cultures compared to retinal cultures alone. In addition, retina-RPE cultures were characterized by reduced up-regulation of glia specific proteins such as GFAP1, GFAP2, Vim1 and Vim2. Dynamic retina cultures in Minuth chambers displayed a reduced degeneration and proliferation of retinal cells, which can be explained by improved medium and oxygen supply as well as physiologic pressure conditions within the chamber. It is known from the literature that cultivated Muller cells induce gliotic membranes following in vivo injection and express collagen I abundantly. It has been shown in this study that the addition of Muller cells to the apical surface (ILM) of retina cultures as well as the addition of collagen I to the culture medium results in histological characteristics similar to epiretinal and intraretinal gliosis observed in vivo. Therefore this culture system can be used as in vitro model for retinal gliosis. Immunohistochemistry of Co-Cultures with Muller cells showed an increase in all glial specific proteins such as GFAP, Vim, S100b and GS in apical Muller cell processes up to the INL. The addition of collagen I, known to induce proliferation in pure Muller cell culture, resulted in increased GFAP- and S100b expression in apical Muller cell processes as well as a reduction of Vim, S100b- and GS expression in basal Muller cell processes.

Fulltext:
PDF