Molekulargenetische und reaktionskinetische Untersuchungen nativer und rekombinanter saccharolytischer Clostridien zur Optimierung der biologischen Wasserstoffproduktion

Klein, Mathias Carsten; Hartmeier, Winfried

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-27088

Molekulargenetische und reaktionskinetische Untersuchungen nativer und rekombinanter saccharolytischer Clostridien zur Optimierung der biologischen Wasserstoffproduktion = Genetic and kinetic investigations of native and recombinant saccharolytic clostridia for the optimisation of the biological hydrogen production

Klein, Mathias Carsten (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Mathias Carsten Klein

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangVI, 132 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Hartmeier, Winfried (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-02-11

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-27088
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50485/files/Klein_Mathias.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Clostridium butyricum (Genormte SW) ; Clostridium (Genormte SW) ; Gentechnologie (Genormte SW) ; Wasserstoff (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Clostridium acetobutylicum (frei) ; [FeFe]-Hydrogenase (frei) ; Thiolase (frei) ; Butyricin 7423 (frei) ; clostridium (frei) ; [FeFe] hydrogenase (frei) ; thiolase (frei) ; metabolic engineering (frei) ; biological hydrogen (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Saccharolytische Clostridien zeichnen sich durch die Produktion einer Vielzahl industriell relevanter Substanzen aus, so dass sie hinsichtlich biologisch-technischer Anwendungen intensiv untersucht werden. Neben Butter- und Essigsäure und den organischen Lösungs-mitteln Aceton bzw. Butanol ist molekularer Wasserstoff eines der Hauptprodukte des Metabolismus der obligat anaeroben Organismen. Viele der für die biologische Produktion von Wasserstoff eingesetzten Clostridien sind jedoch bisher genetisch kaum charakterisiert. Eine wirtschaftliche, biotechnologische Produktion von Wasserstoff insbesondere als alternativem Energieträger erfordert zudem noch Steigerungen sowohl der bislang erzielten Ausbeuten als auch der Produktivität der biologischen Systeme. Eine Alternative zur technischen Prozessoptimierung ist der Einsatz gentechnisch veränderter Produktionsstämme. Zur näheren genetischen Charakterisierung des häufig für die biologische Wasserstoffproduktion eingesetzten C. butyricum wurden die Sequenzen einiger Gene, die für Enzyme des Energiestoffwechsels codieren, mittels Genome Walk aufgeklärt. Die Aktivität der [FeFe]-Hydrogenase konnte durch Coexpression des Enzyms mit den notwendigen Reifungsfaktoren aus C. acetobutylicum in E. coli BL21(DE3) nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die affinitätschromatographisch aufgereinigte Thiolase biochemisch und kinetisch charakterisiert. Die Untersuchung der physiologischen Kondensation von Acetyl-CoA erfolgte mit Hilfe eines gekoppelten Enzymtests, in dem zusätzlich die der Thiolase im clostridialen Metabolismus folgende beta-Hydroxybutyryl-CoA Dehydrogenase (BHBD) aus C. butyricum eingesetzt wurde. Wie alle biosynthetischen Thiolasen liegt das native Enzym aus C. butyricum als Homotetramer vor und besitzt kinetische Eigenschaften, die mit denen verwandter Enzyme vergleichbar sind. Bei der Konstruktion eines geeigneten Shuttle-Vektors für die Klonierung von Genen in C. acetobutylicum konnte auf dem bis dato als kryptisch bezeichneten Plasmid pCB101 aus C. butyricum das für das Bakteriozin Butyricin 7423 codierende Gen identifiziert werden. Es wurde in Form eines Fusionsproteins in E. coli exprimiert und die bakteriozide Aktivität in Plattendiffusionstests auf das gereinigte Genprodukt zurückgeführt. Das Bakteriozin zeigte ausschließlich Wirksamkeit gegenüber Clostridien sowie mehreren Bacillus-Arten. Zur biochemischen Charakterisierung wurde der isoelektrische Punkt des nativen Proteins bestimmt und mittels Gelfiltration gezeigt, dass es zur Ausbildung großer löslicher Aggregate neigt. Im Rahmen eines Metabolic Engineering zur Optimierung der Wasserstoffproduktion in C. acetobutylicum wurden die [FeFe]-Hydrogenase-Gene aus C. butyricum und C. acetobutylicum in einen geeigneten Shuttle-Vektor kloniert und mittels Elektroporation in C. acetobutylicum transformiert. Sowohl die Plasmide als auch die entsprechenden Transkripte konnten in Fermentationen entnommenen Zellen nachgewiesen werden. Die Detektion der entsprechenden Proteine mittels Western Blot und die Bestimmung der spezifischen Enzymaktivitäten zeigten, dass die endogene plasmidcodierte Hydrogenase überexprimiert werden konnte, während die Hydrogenase aus C. butyricum nur in geringen Konzentrationen vorlag. Die Fermentationsergebnisse zeigten allerdings, dass die zusätzlichen Hydrogenasen keinen Einfluss auf Produktbildung von C. acetobutylicum hatten. Die Ausbeuten und Produktivitäten der rekombinanten Stämme bezüglich der Wasserstoffproduktion waren mit denen der Kontrollstämme vergleichbar, so dass davon ausgegangen werden muss, dass die Hydrogenase-Konzentration in der Zelle nicht limitierend für die Wasserstoffbildung in C. acetobutylicum ist. In einem weiteren Ansatz wurden Shuttle-Vektoren für die Expression unterschiedlich langer Antisense-RNAs (asRNAs) gegen das Thiolase-Transkript von C. acetobutylicum konstruiert, um das Verhältnis der organischen Säuren zueinander und somit die Wasserstoffausbeute zu beeinflussen. Die entsprechenden Transkripte konnten spezifisch in den Fermentationen entnommenen Zellen nachgewiesen werden und die verringerten spezifischen Thiolase-Aktivitäten in C. acetobutylicum zeigten, dass die asRNAs die intrazelluläre Thiolase-Konzentration vermindern. Die Analyse der Fermentationen ergab jedoch keine beobachtbaren Veränderungen hinsichtlich der verschiedenen Fermentationsprodukte. Sowohl das Verhältnis der produzierten organischen Säuren als auch die Wasserstoffausbeuten bzw. volumetrischen Produktivitäten blieben unverändert. Somit hat auch die Thiolase-Konzentration in der Zelle zumindest bis zu einem gewissen Grad keinen direkten Einfluss auf den Stoffwechsel des Organismus. Eine Optimierung der biologischen Wasserstoffproduktion durch ein Metabolic Engineering konnte in dieser Arbeit nicht erreicht werden.

Saccharolytic clostridia produce a wide range of industrially relevant substances which explains their intensive exploration concerning biotechnological applications. Besides butyric and acetic acid and the organic solvents butanol and acetone molecular hydrogen is one of the major fermentation products of these obligate anaerobic organisms. Many clostridia applied for biological hydrogen production are still not characterised genetically. The profitable biotechnological production of hydrogen, especially as an alternative energy carrier still affords the enhancement of product yields as well as volumetric productivities. Besides technical process optimisations genetically engineered production strains may be a promising option. An organism often applied for biological hydrogen production is C. butyricum. To further characterise this organism several genes coding for enzymes of the energy metabolism were cloned by genome walk. The activity of the [FeFe]-hydrogenase could be demonstrated by its coexpression with the corresponding maturation proteins in E. coli BL21(DE3). Furthermore Thiolase was purified by affinity chromatography and its biochemical and kinetic properties were determined. The physiological condensation of acetyl-CoA was measured applying a coupled enzymatic assay where beta-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase from the same organism was used as the second enzyme. As all biosynthetic thiolases the native enzyme from C. butyricum forms homotetramers in solution and its kinetic characteristics were comparable to the ones from closely related enzymes. Sequence analysis of the cryptic plasmid pCB101 from C. butyricum revealed the gene coding for the bacteriocin butyricin 7423. It was expressed as a fusion protein in E. coli and its activity was confirmed by plate diffusion assays employing the purified protein. The bacteriocin exhibited activity only on clostridia and several Bacillus species. Gelfiltration revealed that the protein forms large soluble aggregates and for further biochemical characterisation its isoelectric point was determined. To optimise the biological hydrogen production of C. acetobutylicum genetically modified strains were developed. The genes coding for the [FeFe]-hydrogenases from C. butyricum and C. acetobutylicum were cloned into a suitable shuttle-vector and C. acetobutylicum was transformed with the constructed vectors by electroporation. The recombinant strains were subjected to fermentations and plasmids as well as the corresponding transcripts could be detected in withdrawn cell samples. The overexpression of the plasmid encoded endogenous hydrogenase was verified by western blot analysis and determination of the specific enzyme activities whereas the expression of the C. butyricum hydrogenase was rather low. Fermentation patterns of the recombinant strains did not show any alteration at several applied conditions. The hydrogen yields and productivities were comparable to those of the control strains indicating that the cells’ hydrogenase concentrations are not limiting for the biotechnological hydrogen production. Another strategy involved the construction of shuttle-vectors for the expression of antisense-RNAs (asRNAs) targeting the transcript of the C. acetobutylicum biosynthetic thiolase to alter the organic acid ratios and therefore influence the produced hydrogen yields. Again no alteration of the fermentation pattern could be observed although the corresponding transcripts could be detected specifically in cells derived from the conducted fermentations. In all cases the cellular specific thiolase activities were reduced drastically compared to those of the control strains. Therefore the reduction of the intracellular thiolase concentration does not directly influence the organism’s metabolism. In summary no optimisation of the biological hydrogen production of C. acetobutylicum could be achieved by means of metabolic engineering.

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