Präadipozyten auf neuartigen Textilmatrizes

Meersch, Melanie; Pallua, Norbert

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-26092

Präadipozyten auf neuartigen Textilmatrizes = Preadipocytes on novel threedimensional constructs

Meersch, Melanie (Author)

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Melanie Meersch

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangIV, 101 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Pallua, Norbert (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-09-23

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-26092
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50564/files/Meersch_Melanie.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Plastische Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie (533530-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Präadipozyt (Genormte SW) ; Tissue Engineering (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; PKH-26 (frei) ; CM-DiI (frei) ; CFDA-SE (frei) ; Polyesteramid (frei) ; preadipocytes (frei) ; tissue engineering (frei) ; polyesteramide (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Die Rekonstruktion von Weichteilgewebedefekten nach thermischen Unfällen oder tumorchirurgischen Eingriffen stellt weiterhin ein ungelöstes Problem in der Plastischen und Rekonstruktiven Chirurgie dar. Bei begrenzten chirurgischen Möglichkeiten eröffnet das Tissue engineering von Fettgewebe neue Perspektiven. Notwendige Voraussetzungen für eine erfolgreiche Rekonstruktion sind: ein ideales dreidimensionales Konstrukt, autologe Zellen, optimale Kultivierungsbedingungen und eine ausreichende Vaskularisation für spätere in vivo Anwendung. In dieser Studie wird ein Konstrukt aus einem neuen Material (Polyesteramid Typ C) vorgestellt, das mit Fettgewebsvorläuferzellen, so genannten Präadipozyten, besiedelt wurde. Vor Besiedelung der Konstrukte wurden die der Oberfläche anhaftenden Ver¬unreinigungen mit Hilfe eines speziellen Extraktionsverfahrens entfernt und die Vliese nachfolgend gammasterilisiert. Die Präadipozyten wurden aus frisch exzidiertem Gewebe von gesunden Patienten entnommen, die sich elektiven Eingriffen (Abdominoplastiken oder Liposuktionen) unterzogen hatten. Einige Vliese wurden mit Fibronektin beschichtet, um eine bessere Oberflächenstruktur zu schaffen und somit eine Anhaftung der Präadipozyten an die Fasern des Konstruktes zu erleichtern. Nach Besiedelung wurden die Zellen auf den Konstrukten kultiviert und anschließend histologisch zur mikroskopischen und laborchemischen Analyse aufgearbeitet. Um das Verhalten der Präadipozyten sowohl in vitro als auch später in vivo analysieren zu können, wurden Versuche mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Dazu wurden die Fettgewebsvorläuferzellen sofort nach Präparation aus frisch exzidiertem Fettgewebe mit den Markern PKH-26, CM-DiI und CFDA-SE gefärbt und über 30 Tage kultiviert. Das Fluoreszenz-Färbungsmuster wurde mikroskopisch beobachtet und mittels FACS quantifiziert. Die Fettzellreifung ist ein komplexer Prozess, der aus mehreren Entwicklungsstufen besteht und sich somit als langwierig darstellt. Die adipogene Konversion ist durch komplexe Kulturbedingungen optimierbar. In der Literatur wird eine adipogene Wirkung von Stickstoffmonoxid beschrieben, die jedoch eine inadäquate Ausdifferenzierung der Zellen zeigt. Um dies zu evaluieren und das Differenzierungskonzept zu optimieren, wurden unterschiedliche Konzentrationen des NO-Donors DETA/NO im Vergleich zum Trägermolekül DETA verwendet und der Effekt auf die Präadipozyten analysiert. Nach Optimierung der Vliesreinigung ließ sich ein Konstrukt herstellen, welches Präadipozytenanhaftung, Proliferation und Differenzierung ermöglichte. Es zeigten sich vitale Zellen mit guter Anhaftung an die einzelnen Fasern und guter Verteilung innerhalb des gesamten Konstruktes. Die Beschichtung mit Fibronektin, einem Glykoprotein in der Extrazellularmatrix, erlaubte den Fettgewebsvorläuferzellen eine Verbesserung der Zellanhaftung an die einzelnen Fasern des biodegradierbaren Konstruktes, die Proliferationsrate in den Fibronektin-beschichteten Konstrukten war jedoch schwächer als in unbeschichteten Konstrukten. Die Analyse der Fluoreszenzfarbstoffe zeigte relativ hohe Toxizitätsraten für CM-DiI und CFDA-SE. PKH-26 wies eine deutlich niedrigere Toxizitätsrate und die beste Stabilität in den Zellen auf. Alle drei Farbstoffe hatten keinen Einfluss auf das Proliferations- und Differenzierungsverhalten der Zellen. Die Versuche mit dem NO - Donor DETA/NO bestätigten eine adipogene Wirkung von Stickstoffmonoxid auf die Präadipozyten, jedoch mit einer geringen therapeutischen Breite. Die Studie zeigt, dass es sich bei Polyesteramid Typ C um ein viel versprechendes neues Material handelt. Die Vorteile bestehen in einer pH-Stabilität während der Degradation und in einer flexiblen dreidimensionalen Struktur, die sich der Form der Zellen anpassen kann und somit zu einer weitgehend ungehinderten Zellreifung beiträgt. Die zur Optimierung der in vivo Analytik verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind für lange Versuchverläufe nicht anwendbar, da die Intensität der Markierung infolge der hohen Proliferationskapazität der Präadipozyten drastisch abnimmt und die gefärbten Zellen somit nach geringer Zeit nicht mehr nachweisbar sind. Letztendlich bleibt die Problematik bei der Fettgewebszüchtung bestehen: die insuffiziente Vaskularisierung. Es gibt viele gute Ansätze zur Behebung dieser Problematik, jedoch sind weiterführende Studien zur Erforschung dieser Thematik notwendig.

The reconstruction of soft tissue defects after burn injuries or breast resection due to cancer are still an unresolved problem in plastic and reconstructive surgery. Since there are limited surgical possibilities, adipose tissue engineering with preadipocytes offers new perspectives. Essential requirements for successful reconstruction are: adequate threedimensional construct, autologous cells, ideal cultivation conditions and sufficient vascularization for further in vivo experiments. This study evaluates an innovative material consisting of polyesteramide in a 3D nonwoven seeded with preadipocytes, adipogenic precursor cells. Surface contaminations were removed by a surface cleaning procedure followed by vacuum drying and gamma sterilisation. Preadipocytes were isolated out of human subcutaneous adipose tissue of healthy patients who had undergone elective operations. After the isolation procedure, preadipocytes were cultivated in culture dishes and then seeded on the scaffolds. Nonwovens were either precoated with fibronectin or directly used for seeding. Scaffolds were then examined for preadipocytes proliferation and differentiation. To analyze the attitude of preadipocytes in vitro and later in vivo, preadipocytes were tracked with three different fluorescent dyes: PKH-26, CM-DiI and CFDA-SE. After the isolation procedure, preadipocytes were cultivated in culture dishes and stained with the cell tracker according to the recommendation of the manufacturer. Preadipocytes were cultivated for 30 days for microscopical and FACS analyses. The adipogenic conversion consists of several stages of development. As described in the literature, nitric oxide has an adipogenic effect on preadipocytes but shows inadequate differentiation. In order to evaluate this effect and optimize the concept of preadipocyte differentiation, different concentrations of the NO-Donor DETA/NO compared to DETA were used and the effect on preadipocytes was evaluated. After optimizing the cleaning procedures of the construct, the analyses of the nonwovens demonstrate good adherence and spreading of preadipocytes on polyesteramide derived nonwovens. Cells are adequately distributed and most cells are attached to fibers. Precoating with fibronectin displays a significantly higher cell number after seeding. Comparing the three tracking dyes, PKH-26 seems to be the most promising reagent considering toxicity and long-lasting of the labelling. All the three dyes had no effect on proliferation and differentiation of preadipocytes. Analyses with the NO-Donor DETA/NO approve the adipogenic effect of nitric oxide on preadipocytes, but with a low therapeutic index. The results of this study display that polyesteramides are promising materials with high potential for clinical application especially due their pH stability during degradation what leads to less formation of acid degradation products which are often responsible for inflammatory reactions after scaffold implantation. The fluorescent dyes used for optimizing the in vivo analyses are not applicable for long lasting experiments as the luminosity diminishes dramatically due to the high proliferation capacity of preadipocytes. The fact is that the major problem of tissue engineering is still unresolved: the insufficient vascularization. There are many approaches to solve this problem but further experiments are still necessary.

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