Einfluss von Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-[beta]1) Genpolymorphismen auf die Hepatitis-C-induzierte Leberfibrose in vivo und Modulation der TGF-[beta]1-Synthese, Prozessierung und Sekretion durch die Serin-Protease Furin, das latent TGF-[beta] binding protein-1 und Polymorphismen der TGF-[beta]1-Signalsequenz in vitro

Mohren, Simone; Weiskirchen, Ralf

doi:2648

Einfluss von Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-[beta]1) Genpolymorphismen auf die Hepatitis-C-induzierte Leberfibrose in vivo und Modulation der TGF-[beta]1-Synthese, Prozessierung und Sekretion durch die Serin-Protease Furin, das latent TGF-[beta] binding protein-1 und Polymorphismen der TGF-[beta]1-Signalsequenz in vitro = Influence of Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-beta1) gene polymorphisms on hepatitis C induced liver fibrosis in vivo and modulation of TGF-beta1 synthesis, secretion and processing via serin-proteases furin, the latent TGF-beta binding protein-1 and polymorphisms in the coding region of TGF-beta1 in vitro

Mohren, Simone

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Simone Mohren

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangVII, 176 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Weiskirchen, Ralf (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-12-17

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-26484
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50567/files/Mohren_Simone.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Klinische Chemie und Pathobiochemie (526000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Transforming Growth Factor beta 1 (Genormte SW) ; Furin (Genormte SW) ; Hepatitis C (Genormte SW) ; SNP (Genormte SW) ; Leberfibrose (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; TGF-beta1 (frei) ; polymorphisms (frei) ; furin (frei) ; LTBP-1 (frei) ; fibrosis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Im ersten Teil der Experimente wurde der Einfluss des TGF-beta1 Genpolymorphismus im Promotorbereich an Position –509 sowie der SNPs in Codon 10, Codon 25 und Codon 263 auf die Hepatitis C induzierte Leberfibrose in vivo untersucht. Dazu wurden entzündliche Aktivität (Grading) und Fibrosegrad (Staging) von 430 Leberbiopsaten bestimmt, die DNA aus dem in Paraffin eingebetteten Gewebe isoliert und die Genotypen mittels LightCycler Analysen ermittelt. Für die Polymorphismen in Codon 10, Codon 25 und Codon 263 waren in Vorversuchen LightCycler-Programme entworfen worden, die für diese Experimente optimiert werden mussten. Zur Analyse des Polymorphismus an Position –509 wurde ein neues LightCycler-Programm etabliert. Anschließend wurden Geschlecht und Polymorphismen statistisch mit Grading und Staging korreliert. Außerdem wurde untersucht, ob Patienten mit milder Fibrose statistisch signifikant unterschiedliche Allelfrequenzen aufweisen als Patienten mit schwerer Fibrose. Bei der Datenanalyse zeigte sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Geschlecht und dem Fibrosegrad sowie der Art des Polymorphismus in Codon 10 und dem Fibrosegrad. Dabei waren Patienten mit schwerer Fibrose häufiger heterozygot als Patienten mit milder Fibrose. Für die anderen Polymorphismen ergab sich keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Art des Polymorphismus und dem Staging. Außerdem hatten die Polymorphismen keinen Einfluss auf die entzündliche Aktivität. Bei der Analyse der Allelfrequenzen des Promotorpolymorphismus zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen „milde Fibrose“ und „schwere Fibrose“. Patienten mit milder Fibrose wiesen signifikant häufiger das T-Allel und signifikant seltener das C-Allel auf. Außerdem zeigten Patienten der Gruppe „schwere Fibrose“ verglichen mit der Allelverteilung des Gesamtkollektivs signifikant häufiger das C-Allel und signifikant seltener das T-Allel. Zwischen den Gruppen „milde Fibrose“ und „schwere Fibrose“ zeigte sich dabei kein Unterschied in den Allelfrequenzen der anderen Polymorphismen. Bei der Analyse der Haplotypen ergab sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Promotorpolymorphismus und dem Polymorphismus in Codon 10 sowie Codon 263. Außerdem zeigte sich eine signifikante Assoziation zwischen den Polymorphismen in Codon 10 und Codon 25. Im zweiten Teil der Experimente wurden die Einflüsse der Serin-Protease Furin und des Bindungsproteins LTBP-1 sowie der Polymorphismen in Codon 10 und Codon 25 auf Expression und Sekretion des humanen TGF-beta1 in vitro analysiert. Zunächst wurden Vektoren synthetisiert, die hTGF-beta1 C-terminal mit dem enhanced green fluorescent protein (EGFP) oder dem Flag-Oktapeptid fusionierten und das Gen unter die Kontrolle des CMV-Promotors stellten. Diese Plasmide wurden in CHO und LX-2 Zellen eingebracht und die Funktion der Konstrukte mittels Western Blot Analysen, Konfokal- und Immunfluorenszensmikroskopie überprüft. Die Rollen von Furin und LTBP-1 bei der hTGF-beta1 Synthese, Prozessierung und Sekretion wurden durch Ko-Expressionsexperimente untersucht. Dabei wurden die Zellen entweder alleine mit dem hTGF-beta1-Flag Expressionskonstrukt oder zusätzlich mit einem Furin und/oder LTBP-1 Expressionskonstrukt transfiziert. Die hTGF-beta1-Flag-Konzentration der Zelllysate bzw. Überstände wurde in Western Blot und ELISA Analysen verglichen. Außerdem wurden die in vivo vorkommenden Allelvarianten 10Leu/25Arg, 10Pro/25Pro und 10Pro/25Arg der Signalsequenz in hTGF-beta1-Flag Expressionskonstrukte kloniert und deren Einflüsse ebenfalls durch Western Blot und ELISA Analysen untersucht. Der eingesetzte Flag-ELISA wurde für diese Experimente neu etabliert. Die hTGF-beta1 Expressionsplasmide waren sowohl in CHO als auch in LX-2 Zellen aktiv. Durch die Fusion mit dem unter UV-Licht grün fluoreszierenden EGFP konnte in der Konfokalmikroskopie gezeigt werden, dass hTGF-beta1 intrazellulär hauptsächlich im Zytosol in dichten Vesikeln konzentriert vorliegt. Synthese und proteolytische Spaltung von hTGF-beta1 wurden durch Furin und LTBP-1 in den beiden Zellsystemen in unterschiedlicher Weise beeinflusst. In CHO Zellen steigerte die Furin und/oder LTBP-1 Ko-Expression die hTGF-beta1-Konzentration in Zelllysaten und Überständen. Dagegen wurde die hTGF-beta1 Synthese in LX-2 Zellen durch Ko-Expression supprimiert. Die TGF-beta1 Polymorphismen in Codon 10 und Codon 25 beeinflussten ebenfalls die TGF-beta1 Synthese. Die Allelvarianten 10Pro/25Arg und 10Pro/25Pro zeigten in Zelllysaten und Überständen signifikant niedrigere TGF-beta1-Konzentrationen als das 10Leu/25Arg Allel. Folglich demonstrierten die Experimente, dass die Nukleotidsubstitution an Position +869 von Thymin durch Cytosin sowie der Austausch von Guanin durch Cytosin an Position +915 des hTGF-beta1 Gens die hTGF-beta1 Synthese supprimiert.

In the first part of this thesis, the influence of TGF-beta1 polymorphisms at position –509, codon 10, codon 25 and codon 263 on hepatitis C induced liver fibrosis was analysed. For that purpose, liver needle biopsies from 430 patients suffering from chronic hepatitis C infection were scored for the necroinflammatory activity (grading) and degree of hepatic fibrosis (staging). Protocols allowing the isolation of genomic DNA from respective paraffin embedded tissues were optimized and novel LightCycler-genotyping methods for respective allelic variants were established. Subsequently, gender and polymorphisms were statistically correlated with grade and stage of respective samples. In addition, it was tested, if the allele frequencies between patients who suffer from mild or severe fibrosis were different. The data showed a statistically significant association between gender and stage as well as codon 10 and staging. This analysis revealed a significant difference in the allelic frequences at position –509 between the patients suffering from mild or severe fibrosis. Patients being CT or TT at postion –509 had lower stage than patients being CC at this point. There was no correlation of allelic variations and necroinflammatory activity. A significant linkage between the polymorphism at position –509 and the polymorphisms at codon 10 and codon 263 was also found in this analysis. Furthermore, the examinations showed a significant association between the polymorphisms at codon 10 and codon 25. In the second part of the thesis, the influence of the furin convertase, the latent TGF-beta binding protein-1 (LTBP-1) and the individual polymorphisms at codon 10 and codon 25 on the expression and cellular secretion of TGF-beta1 was analysed in vitro. To do so, human TGF-beta1 expression constructs of the allelic variations 10Leu/25Arg, 10Pro/25Pro and 10Pro/25Arg were cloned into a C-terminal Flag tagging vector harbouring the CMV promotor. These vectors were then transfected alone or in combination with expression vectors for furin and LTBP-1 into CHO cells or into LX-2 cells. The expression and secretion was confirmed by Western blot and quantification of Flag-eptitope tagged protein was done in ELISA. In the two cell systems, synthesis and proteolytic cleavage of TGF-beta1 were influenced differently by furin and LTBP-1. In CHO cells, furin and/or LTBP-1 co-expression resulted in an increase of TGF-beta1 in both cell lysate and supernatant. In contrast, the TGF-beta1 synthesis in LX-2 cells was suppressed by furin and LTBP-1. The TGF-beta1 polymorphisms also influenced the total TGF-beta1 concentration. The allelic variations 10Pro/25Arg and 10Pro/25Pro showed a significant lower TGF-beta1 concentration than the 10Leu/25Arg variant. Thus, the experiments showed that the non-synonymous nucleotide substitutions at codon 10 and codon 25 suppress the TGF-beta1 synthesis. Furthermore, a reporter vector in which human TGF-beta1 and the enhanced green fluorescent protein were fused (hTGF-b1-EGFP) was established and the cellular processing of TGF-beta1 was analysed in confocal laser scanning microscopy. The expression of TGF-beta1-EGFP fusion showed that TGF-beta1 is secreted in distinct cytosolic bodies.

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