Biomarker in Atemkondensat und Serum bei asbestbedingten Lungenfibrosen

Conventz, Angela; Kraus, Thomas

doi:HT015867962

Biomarker in Atemkondensat und Serum bei asbestbedingten Lungenfibrosen = Biomarker in exhaled breath condensate and serum in the case of asbestos caused lung fibrosis

Conventz, Angela (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Angela Conventz

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

Umfang126 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Kraus, Thomas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-02-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-27306
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50616/files/Conventz_Angela.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Arbeitsmedizin (521001-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Hydroxyprolin (Genormte SW) ; Lungenfibrose (Genormte SW) ; Biomarker (Genormte SW) ; Prolin (Genormte SW) ; Tyrosin (Genormte SW) ; Serum (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Atemkondensat (frei) ; Nitrotyrosin (frei) ; hydroxyproline (frei) ; nitrotyrosine (frei) ; exhaled breath condensate (frei) ; biomarker (frei) ; asbestosis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das biologische Monitoring nimmt einen großen Stellenwert ein, wenn es um den Nachweis von Fremdstoffen und deren Auswirkungen auf den menschlichen Körper geht. Valide Methoden, die zu einer sicheren Erfassung der inneren Exposition und Risikobewertung führen, sind daher außerordentlich wichtig. Die Entwicklung von Biomarkern bietet dafür eine gute und wichtige Möglichkeit, erste Effekte, die auf Grund vorangegangener Expositionen auftreten, zu detektieren. Im Idealfall sollte ein geeigneter Biomarker in der Lage sein, das Risiko einer Erkrankung abzuschätzen, sodass er, in Kontrolluntersuchungen gemessen, einen wertvollen Beitrag zur Prävention und Frühdiagnostik liefern kann. Um einen Schwellenwert für gefährdete Personen festlegen zu können, muss zunächst ein Parameter gefunden werden, der zwischen erkrankten und nicht erkrankten Personen differenzieren kann. Asbestexposition kann eine Vielzahl von Erkrankungen zur Folge haben, darunter auch die Lungenfibrose. Um der Zielsetzung dieser Arbeit, einen Parameter zu finden, der zwischen Personen mit Fibrose (Fälle) und Personen ohne Fibrose (Kontrollen) differenzieren kann, nach zu kommen, musste überlegt werden, welche Prozesse in Gang kommen, wenn es zur Ausbildung einer Fibrose kommt und darüber hinaus auch, welche Reaktionen auf molekularer Ebene eine Asbestexposition im menschlichen Körper auslöst. Das Vorhandensein von oxidativem und nitrosativem Stress durch vermehrte Radikalbildung bei Asbestexposition und ein erwarteter erhöhter Kollagen-Turnover bei Ausbildung einer Fibrose gaben die möglichen Biomarker vor. Da oxidativer und nitrosativer Stress eng miteinander zusammenhängen, wurde Nitrotyrosin, das in der Literatur vielfach als Biomarker für nitrosativen Stress diskutiert wird, ausgewählt. Ein erhöhter Kollagen-Turnover hat die Freisetzung von Hydroxyprolin zur Folge, welches ausschließlich im Kollagen vorkommt und dort erst nach Einbau von Prolin durch dessen Hydroxylierung gebildet wird. Hydroxyprolin schien daher auch ein geeigneter Marker zu sein, zumal er auch bei anderen Erkrankungen, die einen erhöhten Kollagen-Turnover bedingen, zum Einsatz kommt. Die Messung von Hydroxyprolin und Nitrotyrosin sollte nicht ohne einen Standardisierungsparameter erfolgen. Besonders zur Standardisierung geeignet sind die beiden nicht essentiellen Aminosäuren Prolin und Tyrosin, die jeweiligen Precursor beider Substanzen. Die simultane Detektion dieser vier Substanzen war eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit. Da es sich um sehr polare Substanzen handelt, war der Anspruch, eine Methode zu etablieren, die angemessene Retensionszeiten und eine gute Trennschärfe aller vier Substanzen liefert, mittels Umkehr Phasen Technik nicht zu erreichen. Mit Ausnahme von Nitrotyrosin lieferte hier keine der Substanzen akzeptable Retentionszeiten. Da der Einsatz von “klassischen” Normal Phasen-Säulen sehr viel organisches Laufmittel erfordert hätte, was sowohl die HPLC Pumpendichtungen angegriffen als auch die Methode kompliziert hätte, wurde hier die Anwendung der Hydrophilen-Interaktions-Flüssigkeitschromatographie (HILIC) als technische Alternative gewählt. Sie ist der Normal Phasen Technik ähnlich, da ihre stationäre Phase, Silika-Gel modifiziert mit starken polaren Gruppen, ebenfalls polar ist. Die mobilen Phasen, die für die HILIC verwendet werden, bestehen aus einem wässrigen und einem organischen Eluenten, wobei der wässrige Eluent der stärkste ist. Die simultane Auftrennung gelang mit dieser Technik sehr gut. Gemessen wurde sowohl in Atemkondensat als auch in Serum. In Atemkondensat ist der Verdünnungseffekt sehr groß, dennoch war hier ein Probenvolumen von 1 ml ausreichend, und die Verdünnungseffekte konnten durch den Bezug auf die Standardisierungsparameter sehr gut ausgeglichen werden. In Serum liegen Prolin und Tyrosin in hohen Konzentrationen vor, was einen hohen Verdünnungsfaktor der Proben erfordert. Hydroxyprolin, besonders aber Nitrotyrosin, liegen im Serum in weitaus geringeren Konzentrationen vor, so dass Nitrotyrosin auf Grund des hohen Verdünnungsfaktors im Serum nicht mehr detektiert werden konnte. Die Probanden wurden auf Grund ihres Raucherstatus und ihrer Einteilung in einen Grad der Fibrose, eingeteilt nach internationaler CT-Klassifizierung, in verschiedene Kategorien unterteilt. Der Raucherstatus wurde dabei sowohl anamnestisch als auch durch Messung von Cotinin validiert. Cotinin ist ein Marker für die akute, nicht länger als 3-4 Tage zurückliegende Rauchexposition. Die Verhältnisse von Hydroxyprolin zu Prolin und Nitrotyrosin zu Tyrosin lagen für Atemkondensat bzw. Serum in Bereichen, die in der Literatur beschrieben sind. Tendenziell zeigte sich bei Vorhandensein einer Fibrose und zusätzlicher Belastung durch Rauchen ein erhöhtes Verhältnis von Hydroxyprolin zu Prolin sowohl in Atemkondensat als auch in Serum. Die niedrigsten Hydroxyprolinkonzentrationen, bezogen auf die Prolinkonzentrationen, wurden bei Nichtrauchern ohne Fibrose gefunden. Zwischen den Verhältnissen von Hydroxyprolin zu Prolin in Atemkondensat und denen in Serum konnte dennoch keine direkte Korrelation gefunden werden. Unter Berücksichtigung aller Faktoren scheint es, dass das Verhältnis von Hydroxyprolin zu Prolin in Serum ein vielversprechender Ansatz sein könnte, um bei Rauchern zwischen Fällen und Kontrollen differenzieren zu können. Für das Verhältnis von Nitrotyrosin zu Tyrosin konnte ein eindeutiger Trend dahingehend festgestellt werden, dass Nichtraucher ohne Fibrose die höchsten und Raucher mit Fibrose die niedrigsten Verhältnisse aufweisen. Der Zusammenhang zwischen oxidativem und nitrosativem Stress und dem Einfluss von eisenhaltigen Asbestfasern und Rauchexposition auf die Bildung von Radikalen und anderen zellschädigenden Komponenten ist sehr komplex. Es kann spekuliert werden, dass Kaskaden in Gang kommen, die, anders als in der Literatur für nitrosativen Stress beschrieben, im Fall von Asbestexponierten nicht zu einer Zunahme, sondern zu einer Abnahme des Verhältnisses von Nitrotyrosin zu Tyrosin führen. Diese Hypothese zu validieren wäre ein vielversprechender Ansatz, um möglicherweise auch Nitrotyrosin als Biomarker zur Erkennung einer asbestbedingten Fibrose nutzbar zu machen. Diese Arbeit liefert grundlegende Ideen und Ansätze, um Hydroxyprolin und Nitrotyrosin, bzw. deren Verhältnisse zu ihren Precursorsubstanzen Prolin und Tyrosin als Biomarker zur Erkennung asbestbedingter Fibrosen einsetzen zu können. Durch die Anwendung der neuartigen HILIC konnte eine valide, hoch sensitive und spezifische Methode zur simultanen Detektion aller vier gewünschten Substanzen, Prolin, Hydroxyprolin, Tyrosin und Nitrotyrosin, entwickelt werden. Die erarbeiteten Hypothesen müssen im Rahmen weiterer systematischer Untersuchungen geprüft werden. Dazu liefert das Asbestfrüherkennungsprogramm Aachen ideale Voraussetzungen.

Biological monitoring has a high significance for the detection of impurities and their consequences for human health. Therefore the existence of valid methods to get a certain survey is extraordinary important. The development of biomarkers provides a good and important opportunity to detect first effects developed from former exposures. An appropriate biomarker should be able to evaluate the risk of diseases in sufficient time to give a reasonable contribution for prevention and early diagnoses when measured in preventive medical checkup. To constitute a threshold limit value for persons at risk, first a parameter has to be found which can unequivocally distinguish between diseased and non-diseased persons. The exposure to asbestos can cause a number of different diseases, one of these is lungfibrosis. To achieve the objective target of this thesis, to find a parameter able to differentiate between persons with lungfibrosis (cases) and those without (controls), it was necessary to think about processes starting when fibroses appears. Furthermore some basics of cascades starting after asbestos exposure had to be understood. The existence of oxidative and nitrosative stress occurring because of increased formation of radicals due to asbestos exposure and an expected increased collagen turn-over by reason of a developing fibrosis, provide the possible biomarkers. Because oxidative and nitrosative stress are closely related, nitrotyrosin where choosed, which is often debated in literature to be a marker for nitrosative stress. An increased collagen turn-over dues to augmented release of hydroxyproline. Hydroxyproline only occurs in collagen, being made there by hydroxylation of proline after its incorporation. Therefore hydroxyproline seemed to be an appropriate marker, especially it is also used referred to other diseases causing an increased collagen-turnover. Measurement of hydroxyproline and nitrotyrosine should not be done without a standardisation parameter. Proline and tyrosine, both non-essential amino acids and precursors of hydroxyproline and nitrotyrosine, are very suitable for standardisation. The simultaneous detection of these four substances was an additional aim of the thesis. Because all the four substances were of high polarity, the development of a simultaneous, highly sensitive, accurate and specific LC/MS/MS-method with acceptable retention times were challenging and couldn’t be achieved by the use of reversed phase technique. With the exception of nitrotyrosine, none of the other substances showed good retention times. The application of “classic” normal phase technique would have required a lot of organic eluent, which would have complicated the method and gave adverse effect to the HPLC pump seal. As an alternative the hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) was chosen. This technique is similar to normal phase technique, because its stationary phase is silica-gel modified and therefore also polar. Mobile phases being used for HPLC consist of an aqueous and an organic eluent, whereas the aqueous is the strongest one. Using this technique the simultaneous separation was very successful. Measurements were taken in exhaled breath condensate and serum. In exhaled breath condensate there is a high dilution effect which has to be compensated by relation to the standardisation parameters. The sample volume of 1 ml was still sufficient. In serum proline and tyrosine are high concentrated so a high dilution factor is required. The concentrations of hydroxyproline, but especially the one of nitrotyrosine are much lower, which results in non-detectable amounts of nitrotyrosine in serum due to the high dilution factor. The subjects were grouped by means of their smoking status and their classification into a fibrosis category depending on international CT-classification, into different categories. The smoking status was validated by anamnestic data as well as by determination of cotinine, which is a marker for acute, not older than 3-4 day smoke exposure. The ratio of hydroxyproline to proline and the ratio of nitrotyrosine and tyrosine in exhaled breath condensate and serum respectively were in the ranges known from literature. When fibrosis exist and smoke exposure is also present a tendency can be seen, that the ratio of hydroxyproline to proline is increased, both in exhaled breath condensate and in serum. Lowest concentrations of hydroxyproline based on proline concentration could be found at non-smoking subjects without fibrosis. Anyhow, no direct correlation could be found between ratios of hydroxyproline to proline in exhaled breath condensate and serum. In consideration of all factors, the ratio of hydroxyproline to proline seems to be a promising approach to differentiate smokers into controls and cases. The ratio of nitrotyrosine to tyrosine showed an unambiguous tendency to non-smoking subjects without fibrosis having the highest and smoking subjects with fibrosis having the lowest ratios. The interrelation between oxidative and nitrosative stress including the influence of iron containing asbestos fibres and smoking exposure on the formation of free radicals is very extensive. In the literature it is described that in presents of nitrosative stress the formation of nitrotyrosine will be increased. In this case, it can be speculated that under asbestos exposure there will be cascades starting, leading not to an increased, but to a decreased ratio of nitrotyrosine to tyrosine. The validation of this hypothesis would be a promising approach for the potential use of nitrotyrosine as a biomarker for the detection of asbestos induced lung fibrosis. This theses offers basic ideas and approaches to make hydroxyproline and nitrotyrosine, and their ratio to their precursors proline and tyrosine respectively, suitable as biomarkers for the detection of asbestos induced lung fibrosis. The implementation of the HILIC technique enabled the development of a valid, high sensitive and specific method for the simultaneous detection of proline, hydroxyproline, tyrosine und nitrotyrosine. The developed hypotheses must be proofed within futher systematical investigations. Therefore the “Asbestfrüherkennungsprogramm Aachen” delivers ideal premises.

Fulltext:
PDF