Untersuchung zu (epi)genetischen Veränderungen auf Chromosom 11p15 und ihre funktionelle Relevanz bei Patienten mit Silver-Russell-Syndrom

Schönherr, Nadine; Eggermann, Thomas

doi:HT015874616

Untersuchung zu (epi)genetischen Veränderungen auf Chromosom 11p15 und ihre funktionelle Relevanz bei Patienten mit Silver-Russell-Syndrom = Analyses of (epi)genetic changes in chromosome 11p15 and their functional relevance for Silver-Russell syndrome

Schönherr, Nadine (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nadine Schönherr

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangIV, 138 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Eggermann, Thomas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-02-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-27071
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50646/files/Schoenherr_Nadine.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Humangenetik (525000-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Silver-Russell-Syndrom (Genormte SW) ; Epigenetik (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Wachstumsretardierung (frei) ; Chromosom 11p15 (frei) ; Silver-Russell syndrome (frei) ; epigenetik (frei) ; growth retardation (frei) ; chromosome 11p15 (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Das Silver-Russell-Syndrom (SRS) ist ein heterogenes Fehlbildungssyndrom, das hauptsächlich mit einer schweren intrauterinen und postnatalen Wachstumsretardierung assoziiert ist. Hinzu kommen typische Gesichtsdysmorphien und weitere charakteristische Symptome. Eine genetische Bestätigung des klinischen Befundes ist derzeit lediglich für einen Teil der Patienten möglich, wobei in ~38-63% Aberrationen der Region 11p15 und in 7-10% Defekte auf Chromosom 7 nachgewiesen werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung (epi)genetischer Veränderungen innerhalb der Region 11p15 für das SRS zu untersuchen. Hierzu wurden methylierungsspezifische Analysen bei 72 klinisch gut charakterisierten SRS-Patienten, 188 Patienten der SRS-Routinediagnostik sowie 108 Patienten mit isolierter Wachstumsretardierung durchgeführt. Kürzlich detektierten Gicquel et al. (2005) erstmals Hypomethylierungen der ICR1 (Imprinting Control Region) in 11p15 bei Patienten mit SRS. Aufgrund dieser Beobachtungen erfolgte in der vorliegenden Arbeit eine Häufigkeitsbestimmung dieser Aberration mittels methylierungssensitiver Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification-Analysen. Hierbei konnte in dem Kollektiv von klinisch gut charakterisierten SRS-Patienten eine Rate von 44,4% und bei den Patienten der Routinediagnostik von 15,3% nachgewiesen werden. Bei den 108 Patienten mit isolierter Wachstumsretardierung wurde eine ICR1-Hypomethylierung ausgeschlossen, sodass es sich hierbei mit großer Wahrscheinlichkeit um eine für das SRS spezifische Epimutation handelt. Die methylierungsspezifischen Analysen konnten in dem untersuchten Kollektiv keine weiteren bisher unbeschriebenen (Epi)mutationen in 11p15, wie zum Beispiel Methylierungsdefekte in der ICR2, nachweisen. Auch Hypomethylierungen weiterer geprägter Regionen, zusätzlich zu der ICR1 in 11p15, wurden nicht detektiert. Bisher wurden für die Region 11p15 neben den Methylierungsdefekten der ICR1 bei einzelnen Patienten mit SRS auch maternale Duplikationen detektiert, die immer sowohl die ICR1 als auch die ICR2 mit einschlossen. Der in der vorliegenden Arbeit genauer charakterisierte Fall einer isolierten maternalen Duplikation der ICR2 in 11p15, beschreibt den ersten Fall eines SRS bei dem lediglich die ICR2 betroffen ist und bestätigt somit eine Relevanz geprägter Faktoren dieser Region für das SRS. Bei dem betroffenen Patienten erfolgten Expressionsanalysen des wachstumsrelevanten und geprägten Faktors CDKN1C sowie für das innerhalb der Duplikation lokalisierte Gen KCNQ1. In der vorliegenden Arbeit konnte eine weitere maternale Duplikation in 11p15, die sowohl die ICR1 als auch die ICR2 mit einschloss, detektiert werden. Des Weiteren wurden funktionelle Analysen zu drei Varianten innerhalb des SRS-Kandidatengens H19 durchgeführt. Expressionsanalysen in HEK293- und Cos7-Zellkulturen mit Konstrukten der verschiedenen Varianten zeigten ein verändertes Spliceverhalten bei zwei der drei Patienten (SR81K, SR93K) und deuteten auf eine Relevanz von H19 für das SRS hin. Im Fall der Patientin SR93K erfolgten bestätigende Expressionsanalysen an RNA aus Lymphozyten. Zusätzlich zu Analysen der Region 11p15 erfolgten Untersuchungen zu Veränderungen auf Chromosom 7. Bei zwei Patienten mit SRS konnte hierbei eine segmentale Uniparentale Disomie eines Abschnittes des Chromosoms 7q detektiert werden. Hierbei handelt es sich um eine bisher selten beschriebene Mutation, deren Relevanz für das SRS durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt wurde. Isolierte Methylierungsdefekte innerhalb der geprägten Region 7q32 wurden hingegen bei 54 SRS-Patienten ohne Hypomethylierung in 11p15 nicht nachgewiesen. Um einen möglichen funktionellen Zusammenhang zwischen den mit dem SRS assoziierten Regionen auf den Chromosomen 7 und 11 zu untersuchen, wurden Zwei-Farben-FISH Analysen in plazentaren Interphase-Kernen zu potentiellen interchromosomalen Interaktionen dieser Regionen durchgeführt. Eine Kolokalisation der Region 11p15 mit 7p12-p11.2 (GRB10) und 7q32 (PEG1/MEST) konnte in einzelnen Zellkernen nachgewiesen werden. Die beobachteten Interaktionen beschränkten sich fast ausschließlich auf jeweils ein elterliches Allel, was vermutlich auf die elterliche Prägung der Regionen zurückzuführen ist. Quantitative Expressionsanalysen sollten zeigen, ob es eine Beeinflussung der Expression der in 7p12-p11.2 und 7q32 lokalisierten geprägten SRS Kandidatengene durch das Protein CTCF gibt. CTCF ist ein Regulator der Expression und des Imprintings diverser Gene, u.a. der ICR1 in 11p15. Hierbei konnte eine deutliche Inhibition der Expression des wachstumsrelevanten Faktors PEG1/MEST in 7q bei erhöhter CTCF Konzentration in primären Trophoblasten-Zellkulturen nachgewiesen werden. Eine Regulation dieser beiden mit dem SRS assoziierten Regionen durch einen gemeinsamen übergeordneten Mechanismus ist somit vorstellbar und könnte ihren Zusammenhang an der Ätiologie des SRS erklären.

Silver-Russell syndrome (SRS) is a heterogenous syndrome which is mainly associated with severe intrauterine and postnatal growth retardation. Typical facial dysmorphisms and further characteristic symptoms can additionally be observed. So far the clinical diagnosis can not be confirmed in all patients with SRS. ~38-63% of SRS patients carry (epi)genetic mutations in 11p15 and in ~7-10% defects on chromosome 7 can be detected. One of the main tasks of this doctoral thesis was the analyses of (epi)genetic changes in the chromosomal region 11p15 and the verification of their functional relevance for the etiology of SRS. Therefore methylation-specific analyses were carried out in 72 well characterised patients with SRS, 188 patients referred for routine SRS-diagnostics and additional 108 patients with isolated growth retardation. Recently Gicquel et al. (2005) firstly detected a hypomethylation of the ICR1 (Imprinting Control Region 1) in 11p15 in patients with SRS. Due to these observations we carried out Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification analyses to determine the frequency of this aberration. While 44.4% of the well characterised SRS patients showed hypomethylation of the ICR1, in patients from routine SRS diagnostics a frequency of only 15.3% could be detected. None of the patients with isolated growth retardation showed a hypomethylation of 11p15, thereby confirming the assumption that this epimutation is specific for SRS. Further analyses of the results from this methylation specific assay did not reveal any other so far unknown (epi)genetic disturbances in 11p15, such as methylation defects in the ICR2. Hypomethylation of further imprinted regions in the genome additionally to the ICR1 could also not be detected in the analysed SRS patients. It is well known that some patients with SRS show a maternal duplication in 11p15 always including both imprinting control regions, ICR1 and ICR2. In this study we could detect the first case with a maternal duplication restricted to the ICR2 in 11p15 in a patient with SRS, thus making a relevance of imprinted factors in the ICR2 for the etiology of SRS probable. Investigations on the functional consequence of this duplication were carried out by analysing the expression of the growth relevant and imprinted factor CDKN1C and a further gene (KCNQ1) localised in the duplicated region. In addition to this case we could detect another patient with SRS showing a maternal duplication in 11p15, including both ICRs. Moreover, functional analyses on three variations of the genomic sequence in the SRS-candidate gene H19 have been performed. We therefore carried out expression analyses in cultured HEK293- and Cos7-cells after transfection with constructs containing the different variants. An altered splicing of the H19 mRNA in comparison to wild-type construct could be found in two of the three patients (SR81K; SR93K), therefore indicating a relevance of H19 for the etiology of SRS. In case of the patient SR93K analyses of RNA from lymphocytes could confirm the former results. In addition to the analyses for chromosome 11p15 we performed investigations on disturbances of chromosome 7. Two of the analysed SRS patients showed a segmental uniparental disomy of chromosome 7q, which is a very rare aberration and to date only reported in two further cases of SRS. Therefore, our results clearly support the relevance of this scarce genetic finding. Isolated methylation defects in the imprinted region 7q32 - which might have a functional role in SRS - could not be observed in 54 SRS patients without hypomethylation in 11p15. To determine a possible functional link between the different imprinted regions associated with SRS on chromosome 11 and 7, we carried out analyses to detect potential interchromosomal interactions between these regions. Multicolour-FISH analyses showed a colocalisation of the chromosomal region 11p15 with 7p12-p11.2 (GRB10) and 7q32 (PEG1/MEST) in single placental interphase nuclei. These interactions were always restricted to one allele, which might lead to the assumption that, due to the imprinting of these regions, the association is essential only between the two chromosomes of one defined parental origin. Furthermore quantitative analyses were carried out to show a possible influence of the protein CTCF on the expression of the genes localised in the SRS-candidate regions 7p12-p11.2 and 7q32. CTCF is a regulator of expression and imprinting of various genes, among others for the genes localised in the ICR1. Analyses in placental primary cell cultures clearly showed an inhibition of the PEG1/MEST expression by CTCF. Therefore a common mechanism for the regulation of these two SRS-associated regions is conceivable and might explain their link in the etiology of SRS.

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