Stabilitäten der Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens und der Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis in wässrig-organischen Zweiphasensystemen

van den Wittenboer, Anne; Wolf, Klaus

doi:29536

Stabilitäten der Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens und der Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis in wässrig-organischen Zweiphasensystemen = Stabilities of benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens and carbonyl reductase from Candida parapsilosis in aqueous-organic biphasic systems

van den Wittenboer, Anne

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anne van den Wittenboer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangVI, 142 S. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wolf, Klaus (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-07-16

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-29171
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51263/files/vandenWittenboer_Anne.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Enzymtechnologie (Genormte SW) ; Enzyminaktivierung (Genormte SW) ; Organisches Lösungsmittel (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; chemische Modifizierung (frei) ; gerichtete Mutagenese (frei) ; Prozessstabilität (frei) ; enzyme technology (frei) ; organic solvents (frei) ; chemical modification (frei) ; site-directed mutagenesis (frei) ; process stability (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens (BAL) und die Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) stellen aufgrund der von ihnen katalysierten Reaktionen sehr interessante Enzyme für die Herstellung verschiedener chiraler Intermediate dar, die vor allem für die pharmazeutische Industrie von Bedeutung sind. Aufgrund der meist hydrophoben Reaktanden können in wässrigen Reaktionssystemen jedoch nur geringe Produktivitäten erzielt werden, weshalb sich die Verwendung alternativer Reaktionsmedien anbietet. Besonders der Einsatz in wässrig-organischen Zweiphasensystemen ist vielversprechend, da durch die Extraktion des Produkts und die räumliche Trennung vom Enzym ein effizienter Prozess möglich ist. Allerdings weisen beide Enzyme eine unzureichende Stabilität in diesen Systemen auf, sodass eine Stabilisierung unerlässlich ist. Die Stabilität beider Enzyme wurde in jeweils drei verschiedenen Zweiphasensystemen sowie den jeweils lösungsmittelgesättigten wässrigen Einphasensystemen ermittelt (BAL: MTBE, 2 Oktanon, Toluol; CPCR: MTBE, Cyclohexan, n Heptan). Dabei zeigte sich, dass die BAL bereits durch gelöste Lösungsmittelmoleküle in der wässrigen Phase eine signifikante Inaktivierung erfuhr. In den entsprechenden Zweiphasensystemen zogen insbesondere die Grenzflächen zu 2 Oktanon und Toluol eine deutliche zusätzliche Inaktivierung nach sich. Die CPCR wurde auf molekularer Ebene vor allem durch gelöste MTBE-Moleküle inaktiviert. Dagegen hatten gelöste Cyclohexan- und n Heptanmoleküle nur einen geringen Einfluss auf die Stabilität, führten jedoch in den jeweiligen Zweiphasensystemen zu einer deutlichen Inaktivierung. Da die Inaktivierung wahrscheinlich aus Interaktionen zwischen den Lösungsmitteln und der Proteinoberfläche resultiert, wurden die Oberflächeneigenschaften beider Enzyme dahingehend verändert, dass diese Interaktionen möglichst unterdrückt werden. Durch chemische Modifikation der freien Aminogruppen wurden neue chemische Funktionalitäten auf die Proteinoberfläche gebracht. Die Acetylierung mit cyclischen Anhydriden führte zu deutlichen Aktivitätsverlusten beider Enzyme. Dagegen konnte die Modifizierung mit mPEG750 und mPEG2000 für die BAL mit vergleichsweise guten Restaktivitäten (60-70%) durchgeführt werden, während die CPCR nach der Modifizierung nicht einmal 10% Restaktivität aufwies. Gelelektrophoretische Untersuchungen ergaben, dass nur wenige Aminogruppen der BAL für die mPEG-Moleküle zugänglich waren, während die CPCR offenbar sehr stark modifiziert wurde. Lagerstabilitätsmessungen mit den mPEG-BAL-Varianten zeigten, dass besonders in den Lösungsmittelsystemen mit MTBE und Toluol eine deutliche Stabilitätssteigerung gegenüber gelösten Lösungsmittelmolekülen erzielt wurde. Mittels gerichteter Mutagenese wurden hydrophobe oberflächenständige Aminosäurereste gegen polare Aminosäurereste ausgetauscht, wodurch sich weniger Interaktionen mit den Lösungsmitteln ergeben sollten. Die erzeugten BAL-Varianten wiesen größtenteils vergleichbare Aktivitäten auf wie die native BAL, während die meisten CPCR-Varianten einen deutlichen Aktivitätsverlust zeigten. In beiden Fällen wurde die Enantioselektivität der Enzyme nicht beeinflusst. Die kinetischen Konstanten der BAL-Varianten unterschieden sich kaum von denen der nativen BAL. Die CPCR-Varianten zeigten sowohl für die Reduktions- als auch für die Oxidationsreaktion höhere Wechselzahlen als die native CPCR. Lagerstabilitätsmessungen in den jeweiligen Ein- und Zweiphasensystemen ergaben, dass die meisten Varianten eine geringere Stabilität gegenüber gelösten Lösungsmittelmolekülen aufwiesen als die nativen Enzyme. Allerdings wurde die zusätzliche Inaktivierung an der Grenzfläche zu Toluol (BAL) bzw. MTBE, Cyclohexan und n-Heptan (CPCR) durch die eingebrachten Mutationen verringert. Da für die technische Anwendung vor allem die Enzymstabilität unter relevanten Prozessbedingungen von Bedeutung ist, wurde ein Messaufbau für Stabilitätsmessungen in reaktiven, wässrig-organischen Zweiphasensystemen etabliert. Für die BAL zeigte sich, dass unter Reaktionsbedingungen offenbar die Inaktivierung durch das Aldehydsubstrat die Inaktivierung durch die Lösungsmittel überlagert, sodass sich kaum Stabilitätsunterschiede in den verschiedenen Zweiphasensystemen ergaben. Weder durch die mPEG-Modifizierung noch durch die eingebrachten Mutationen wurde die Inaktivierung durch das Substrat unterdrückt. Die CPCR wies unter Prozessbedingungen im MTBE-System eine stark reduzierte Halbwertszeit auf, wahrscheinlich aufgrund eines kombinierten Effektes der gelösten MTBE-Moleküle und des Isopropanols, welches zur substratgekoppelten Cofaktorregenerierung verwendet wurde. Die CPCR-Stabilität im reaktiven System mit Cyclohexan und n-Heptan war mit der Stabilität unter nicht-reaktiven Bedingungen vergleichbar. Die CPCR-Variante CPCR-I79T,V83S wies in allen drei Zweiphasensystemen eine höhere Stabilität auf als die native CPCR.

Benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens (BAL) and carbonylreductase from Candida parapsilosis (CPCR) are versatile catalysts for the production of various chiral intermediates, which are of interest for the pharmaceutical industry. Due to the mostly hydrophobic reactants only low productivities can be achieved in aqueous reaction systems and thus the use of alternative reaction media is desirable. Especially the use of aqueous-organic biphasic systems is promising, since the extraction of products and the spatial separation from the enzyme facilitate efficient processes. However, both enzymes show only insufficient stability in these systems and therefore a stabilisation is indispensable. Stability of both enzymes was determined in three different biphasic systems as well as the respective solvent-saturated aqueous monophasic systems (BAL: MTBE, 2 octanone, toluene; CPCR: MTBE, cyclohexane, n heptane). It was shown that BAL was already significantly deactivated by the solvent molecules within the aqueous phase. In the respective biphasic systems especially the interfaces towards 2-octanone and toluene led to considerable additional deactivation. On the molecular level CPCR was deactivated mainly by dissolved MTBE-molecules. In contrast, dissolved cyclohexane and n-heptane molecules only had minor effects on CPCR stability, whereas the respective biphasic systems led to significant deactivation of CPCR. The deactivation by the solvents is probably a result of interactions between the solvents and the proteins’ surfaces. Therefore the surface characteristics of both enzymes were altered in order to prevent these interactions. Chemical modification of free amino groups was applied to introduce new chemical functionalities to the enzymes’ surfaces. Acetylation with cyclic anhydrides decreased activity of both enzymes significantly. In contrast, modification with mPEG750 and mPEG2000 resulted in good residual activities of BAL (60-70%), while CPCR retained less than 10% residual activity. Gel electrophoresis showed that apparently only few amino groups of BAL were accessible for mPEG-modification, whereas CPCR was modified to great extent. Storage stability measurements with the mPEG-BAL-variants revealed a considerable increase of stability towards dissolved molecules in the solvent systems with MTBE and toluene. Site-directed mutagenesis was applied to exchange unpolar surface amino acid residues against polar amino acid residues in order to decrease interactions between the enzymes and the solvents. Most of the resulting BAL-variants showed similar activities as the native BAL, whereas many CPCR-variants lost most of their activity. For both enzymes enantioselectivity was unaffected by the introduced mutations. Kinetic constants of BAL-variants differed only marginally from the ones of native BAL. CPCR-variants exhibited higher kcat-values than native CPCR in both reduction- and oxidation reaction. Determination of storage stability in the different mono-and biphasic systems showed that most variants exhibited decreased stability against dissolved solvent molecules compared to native enzymes. However, additional deactivation at the interface towards toluene (BAL) and MTBE, cyclohexane und n-heptane (CPCR) respectively, was decreased. For the technical application enzyme stability under relevant process conditions is of importance. Therefore a reactor set-up was established, that allows stability determination in reactive, aqueous-organic biphasic systems. Respective measurements with BAL indicated that deactivation by the aldehyde substrate superimposed the deactivation by the solvents, thus resulting in similar BAL stability in all tested solvent systems. Neither the mPEG-modification nor the introduced mutations prevented this deactivation by the substrate. CPCR showed a strong stability decrease under process conditions in the MTBE-system, probably due to a combined effect of dissolved MTBE-molecules and isopropanol which was used for substrate-coupled cofactor regeneration. CPCR stability in reactive systems with cyclohexane and n-heptane was comparable to stability under non-reactive conditions. Variant CPCR-I79T,V83S showed increased process stability in all three biphasic systems.

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