Nanostrukturierte Metallelektroden zur funktionalen Kopplung an neuronale Zellen

Brüggemann, Dorothea; Offenhäusser, Andreas

doi:hsb910020210

Nanostrukturierte Metallelektroden zur funktionalen Kopplung an neuronale Zellen = Nanostructured metal electrodes for functional coupling with neuronal cells

Brüggemann, Dorothea

2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Dorothea Brüggemann

ImpressumAachen : Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek, Verl. 2010

UmfangVII, 160 S. : Ill., graph. Darst.

ISBN978-3-89336-627-9

ReiheSchriften des Forschungszentrums Jülich : Reihe Information ; 9

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-04-29

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-32549
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51748/files/3254.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Bioelektronik (Genormte SW) ; Nanostruktur (Genormte SW) ; Mikroelektrode (Genormte SW) ; Biosensor (Genormte SW) ; Physik (frei) ; Zellkopplung (frei) ; biosensor (frei) ; microelectrode (frei) ; cell coupling (frei) ; nanostructures (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 530

Kurzfassung
In der modernen biomedizinischen Forschung steigt stetig die Nachfrage nach neuartigen Biosensoren, die die Schnittstelle zwischen physikalischen und biologischen Systemen bilden. Solche bioelektronischen Systeme werden z.B. zur Ableitung extrazellulärer Signale von elektrisch aktiven Zellen oder zur Detektion von DNA eingesetzt. In zunehmendem Maße finden sie auch Verwendung als Neuroimplantate oder Testsysteme für neue pharmazeutische Wirkstoffe. Zur Ableitung extrazellulärer Signale wurden bislang planare Mikroelektroden aus verschiedenen biokompatiblen Metallen verwendet, die seit den 70er Jahren in der Bioelektronik etabliert sind. Um die Qualität der abgeleiteten Signale zu verbessern, wurde das Elektrodendesign stetig weiterentwickelt. Maßgebend für die Signalqualität ist das Signal-Rausch-Verhältnis (SRV), das durch die Schnittstelle zwischen Zelle und Elektrode bestimmt wird. Die Vergrößerung der effektiven Elektrodenoberfläche mit unterschiedlichen porösen Materialien hat bereits zu einer Erhöhung des SRVs geführt. Allerdings zeigten bisherige poröse Elektroden Probleme in der mechanischen Stabilität und der Adhäsion von Zellen und Gewebe. Überdies ist die Herstellung aufwändig und eine Wiederverwendung der Elektroden nur eingeschränkt möglich. Einen neuen, vielversprechenden Lösungsansatz zur Verbesserung der Signalableitung stellt die Modifikation von Mikroelektroden-Arrays (MEAs) mit dreidimensionalen metallischen Nanostrukturen dar. Die Entwicklung und Charakterisierung dieser nanostrukturierten Biochips sowie deren Kopplung an elektrisch aktive Zellen bildeten den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Als Material für die Nanostrukturen wurde Gold gewählt, da es aufgrund seiner chemischen und mechanischen Beständigkeit sowie seiner Biokompatiblität für bioelektronische Anwendungen prädestiniert ist. Außerdem besteht über Thiolbindungen die Möglichkeit verschiedener Oberflächenmodifikationen zur gezielten Beeinflussung des Zellwachstums. Zunächst wurden mittels nanoporöser Aluminiumoxid-Membranen und elektrochemischer Deposition großflächige Arrays aus Gold-Nanopillars hergestellt. Durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden Zusammenhänge zwischen der Nanostruktur-Geometrie und den Parametern des Herstellungsprozesses gefunden. Die resultierenden Nanopillars waren 300 bis 400 nm hoch und hatten einen mittleren Durchmesser von ca. 60 nm. Es folgten elektrochemische Untersuchungen der Nanopillar-Arrays mittels Impedanzspektroskopie und Zyklovoltametrie. Diese Studien belegten, dass die effektive Oberfläche aufgrund der Nanostrukturen deutlich erhöht war. Durch die Oberflächenvergrößerung konnte die Impedanz gegenüber planaren Goldflächen erheblich gesenkt werden. Demnach war die Kapazität der Nanopillars im Vergleich zu planarem Gold sogar um eine Größenordnung erhöht. Nach der geometrischen und elektrochemischen Charakterisierung der Gold-Nanopillar-Arrays wurde die Vitalität und Adhäsion verschiedener elektroaktiver Zellen auf diesen Flächen studiert, um ihre Eignung als bioelektronische Schnittstelle zu evaluieren. Zur Optimierung des Zellwachstums wurden die Nanostrukturen in Abhängigkeit vom Zelltyp mit verschiedenen Oberflächenmodifikationen, wie z.B. Proteinen oder Self-Assembled Monolayers versehen. Die Überlebensrate der verschiedenen Zelltypen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Herzmuskelzellen (HL1) und Nierenepithelzellen (HEK) zeigten eine gute Adhäsion sowie eine hohe Überlebensrate auf den Gold-Nanopillar-Oberflächen, die vergleichbar zur Entwicklung dieser Zelllinien auf planarem Gold waren. Für primäre Rattenneuronen (RCN) wurden allerdings eine unerwartet niedrige Zellvitalität und schwache Adhäsion auf den Nanostrukturen beobachtet, die sich stark vom Zellwachstum auf planaren Goldsubstraten unterschieden. Weiterführende Untersuchungen der Schnittstelle zwischen Zelle und Nanopillar-Arrays durch einen fokussierten Ionenstrahl zeigten eine dichte Kopplung von HL1- und HEK-Zellen an die Nanostrukturen. Für RCN auf Nanopillars wurde zwar eine starke Adhäsion der Neuriten beobachtet, allerdings waren die Abstände zwischen Zellkörper und Pillars auffallend hoch. Zudem ergaben Untersuchungen der Aktinfilamente mittels Fluoreszenzfärbung starke Veränderungen der neuronalen Wachstumskegel, die für die schwache Adhäsion von RCN mitverantwortlich sein können. Damit wurde nachgewiesen, dass HL1- und HEK-Zellen dicht an Gold-Nanostrukturen koppeln. Die Adhäsion von RCN auf den Nanopillars war dagegen stark eingeschränkt und hing zudem von der jeweiligen Zellregion ab, die in Kontakt mit den Pillars war. Im letzten Versuchsteil erfolgte der Schritt von großflächigen Gold-Nanopillar-Arrays hin zu nanostrukturierten MEAs. Zur Fabrikation dieser neuartigen Biochips wurden Mikrofabrikationstechniken (Photolithographie, Metallisierung, Passivierung und Ätzprozesse) im Reinraum eingesetzt, danach folgte die Nanostrukturierung. Für die Ableitung extrazellulärer Signale wurden aufgrund der zuvor nachgewiesenen starken Kopplung an Gold-Nanopillars HL1-Zellen gewählt. Mit den Nano-MEAs konnten reproduzierbare Aktionspotenziale von HL1-Zellen abgeleitet werden. Ein Vergleich des SRVs mit Referenzmessungen an planaren Gold-MEAs zeigte, dass die Signalqualität bei Ableitungen mit nanostrukturierten MEAs maximal um den Faktor 2 erhöht war. Im Vergleich zur elektrochemisch ermittelten Kapazitätserhöhung an großflächigen Arrays aus Gold-Nanopillars, die eine ganze Größenordnung betrug, ist dieser Vergrößerungsfaktor relativ gering. Allerdings ist durch eine Modifikation der Nanopillar-Geometrie, vor allem der Höhe, eine weitere Vergrößerung des SRVs von nanostrukturierten MEAs zu erwarten. Starken Einfluss auf die Signalqualität hat auch die Passivierungsschicht der MEAs. Um Leckströme bei der Signalableitung zu vermeiden, die das SRV negativ beeinflussen, sollte die Passivierung möglichst dicht und chemisch stabil sein. Außerdem kann in Zukunft durch die Verwendung von einzelnen Nanopillars eine zunehmende Miniaturisierung der Elektroden erreicht werden. Mit diesem Design könnte später vielleicht sogar die Ableitung von intrazellulären Signalen durch Eindringen der Pillars in den Zellkörper erreicht werden.

The focus of this dissertation was to develop and investigate nanostructured gold interfaces for signal recordings from electroactive cells. Currently, the use of planar microelectrode arrays (MEAs) is an established technique for such extracellular recordings. However, a high impedance and a low signal-to-noise ratio are challenges, which have to be addressed for the recording of high quality measurements with MEAs. The aim of this research project was to improve cell-electrode interfaces via nanostructuring of the metal surface. The characteristics of interest were cell adhesion, spatial resolution, and electronic signal transduction of the novel cell-electrode interfaces. For the fabrication of these interfaces clean room technologies, e.g. photolithography and metallisation, were used. The nanostructures were produced by anodisation of an aluminium film in acid which yielded self-assembled nanopores. This porous membrane was filled with gold using galvanisation to produce freestanding gold nanopillars. Afterwards, the 3D geometrical surface of the nanopillars was characterised via scanning electron microscopy (SEM). It is now possible to control the parameters of the self-ordered process, e.g. acid temperature, applied voltage, and etching time to fabricate nanopillars with reproducible dimensions. Electrochemical methods such as impedance spectroscopy and cyclic voltammetry were employed to measure impedance and capacitance of the pillars in different electrolytes. Both methods yielded higher capacitances and consequently lower impedances for gold nanopillars than for planar gold. This result confirmed the expected increase of the surface area via nanostructuring. In the following cell coupling experiments the viability of different electrogenic cells types (i.e. cells which induce small electric signals) was analysed employing fluorescence microscopy and SEM analysis. Various surface modifications, e.g. proteins and self-assembled monolayers, were employed to influence the cell-adhesive response to the nanostructures. Cardiac muscle (HL1) and human embryonic kidney (HEK) cells adhered and survived on the nanopillars, but primary rat neurons showed unexpectedly low viability and adhesion on the nanopillars. In a crossectional analysis of the cell-nanostructure interface via focussed ion beam large distances between the neuronal cell body and the nanostructures were found. Contrarily, the neurites of these primary cells as well as HL1 and HEK cells adhered tightly. Furthermore, actin assembly within the growth cones of the adherent neurons was drastically modified when growing on the nanopillars. Hence, while gold nanopillars support interactions with some cell types, the cell-adhesive response to the nano-scale environment differs depending on cell type and region of the cell being examined. Finally, MEAs with gold nanopillars were fabricated and could be used for the first time to record extracellular signals from HL1 cells. Good coupling between the HL1 cells and the nanostructured electrodes was observed repeatedly. The resulting signal-to-noise ratio of nanopillar-MEAs was increased by a factor of 2 compared to planar MEAs. In summary, gold nanopillar electrodes showed excellent behaviour for bioelectronic interfaces due to their reduced impedance and biocompatibility. In future applications this nanopillar concept can be adopted for distinct interface materials of electronic circuits and their coupling to cellular and molecular sensing components.

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